Lrrc10蛋白的表達、純化及多克隆抗體的制備

閔 璐，周云雷，周 煌，吳秀山，袁婺洲

(湖南師范大學蛋白質化學與發育生物學教育部重點實驗室，心臟發育研究中心，中國 長沙 410081)

Lrrc10 (Leucine-rich Repeat Containing protein 10)是第一個被報道的具有心臟特異性表達的LRR(leucine-rich repeat，富亮氨酸重復序列)家族蛋白．近年來，多個實驗室對小鼠Lrrc10 基因進行了研究報道，它是一個無內含子的基因，在小鼠心臟組織中有大量的特異性表達．Lrrc10在小鼠胚胎期心臟的表達部位與NKX2-5/CSX(cardiacspecifichomeobox)表達極其相似，亞細胞定位實驗顯示Lrrc10在細胞質與細胞核都有表達，進一步分離的新生大鼠心肌細胞實驗證明了是在Z-線上和橫小管上表達[1]．RNA干擾斑馬魚Lrrc10 后，斑馬魚胚胎的心臟不能正常環化，心臟收縮因子cmlc-2(cardiacessentialmyosinlightchain-1)的表達下調，胚胎發育6～7天后死亡．這說明Lrrc10 對于斑馬魚胚胎期心臟的形成和功能至關重要[2]．

但是Nikolay指出[3]，Lrrc10 敲除小鼠的心臟發育并沒有出現異?，F象，Lrrc10基因對于小鼠心臟的發育并非必需．也許是因為小鼠心臟發育的復雜程度高于斑馬魚，Lrrc10蛋白在小鼠心臟中的缺失，可能有其他同源性較高的功能相似的蛋白起到了代償作用，具體原因有待進一步研究．

同時，人類與小鼠的Lrrc10 基因在氨基酸水平的相似性高達84%．Lrrc10在人類心臟組織中也特異性表達．雖然小鼠Lrrc10 基因敲除后對心臟發育和功能沒有影響，但是并不代表其在心臟發育過程中沒有作用．利用DMSO誘導P19CL6細胞分化研究表明：Lrrc10基因在P19CL6細胞分化第3天開始表達，說明Lrrc10基因可能與心肌分化相關．本實驗通過制備Lrrc10融合蛋白表達載體，成功免疫新西蘭大白兔，獲得效價高、特異識別Lrrc10蛋白的多克隆抗體，為深入研究Lrrc10在心肌分化中的功能奠定了基礎．

1 材料與方法

1.1 主要試劑

大腸桿菌BL21菌種，pGEX-4T-1菌種以及DH5α菌種為本實驗室保種； pMD18-T載體和連接酶購自大連寶生物公司；RNase購自Sangon公司；10×Loading buffer、Taq DNA聚合酶、限制性內切酶EcoRⅠ和SalⅠ購自深圳晶美公司；質粒提取試劑盒(離心柱型)購自OMEGA；UNIQ-10柱式DNA 膠回收純化試劑盒購自上海生工公司；柱式DNA膠回收試劑盒購自TIANGEN；蛋白胨、甲叉雙丙烯酰胺、酵母提取物、IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)丙烯酰胺、氯化鈉、過硫酸銨等購自上海生工公司；Glutathione SepharoseTM 4B購自Amersham Biotech 公司；弗氏完全佐劑、不完全佐劑購自Sigma公司．

1.2 引物設計與合成

根據巢式PCR的原理和Lrrc10基因的序列設計引物.第一對引物：Z-Lrrc10上游引物: 5′GTTGGT GGGCAGGGGCTCGCC 3′Z-Lrrc10下游引物: 5′AGCAATTCAGAGGACCCAT 3′；第二對帶有酶切位點的引物：Z-Lrrc10上游引物 :5′GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCT 3′EcoRⅠ，Z-Lrrc10 下游引物:5′AGGTCGACACGATTCCGGGAGGACACAGAA 3′SalⅠ由上海生工公司合成．

1.3 基因擴增及克隆

首先以小鼠心臟cDNA文庫為模板用第一對引物進行PCR擴增，用第二對引物以第一次PCR產物為模板進行PCR(反應條件為：94 ℃ 變性4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2min，30個循環；72 ℃延伸8 min)．純化PCR產物，獲得300 bp的目的片段，然后將其連入T載體，轉化入DH5α感受態細胞中，酶切檢測篩選出陽性單克隆，經測序鑒定后將DNA片段用EcoRⅠ和SalⅠ從pMD18-T-Lrrc10 質粒上切下，連入相同酶切位點線性化的pGEX-4T-1載體，轉入DH5α感受態細胞中，經EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定后，得到重組表達質粒pGEX-4T-1-Lrrc10．

1.4 Lrrc10融合蛋白的誘導表達

將質粒pGEX-4T-1-Lrrc10轉入BL21感受態細胞，挑取單克隆，接種于25 mL含100 mg/L 氨芐青霉素的LB培養基中，37 ℃培養至OD600約為0.6，取1 mL菌液作為空白對照，然后加IPTG誘導，25 ℃繼續培養，1、2、3、4、5、6 h各取1 mL菌液，確定最佳誘導時間．

1.5 Lrrc10融合蛋白親和純化

離心收集菌液，用PBS重懸菌液后超聲裂解，裂解至菌液清亮后離心收集上清．4 ℃條件下加入用PBS活化的谷胱甘肽瓊脂糖珠4B，結合后用PBS洗去雜蛋白，加入適當體積的洗脫液混勻，離心收集上清即Lrrc10融合蛋白，保存于-80 ℃．

1.6 Lrrc10多克隆抗體的制備

以新西蘭大白兔(約2.0～2.1 kg 雄免)免疫前正常血清為陰性對照(耳緣靜脈取血)．將純化后的GST-Lrrc10蛋白與弗氏完全佐劑按體積比1∶1在注射器中推成乳劑，分散10～20個點對同一新西蘭大白兔進行背部皮下免疫注射．在第一次注射后第14、21、28天，將GST-Lrrc10蛋白按體積比1∶1與弗氏不完全佐劑在注射器中推成乳劑，進行再次免疫．第35天主動脈取血，靜置過夜(4 ℃)，3 000 r/min離心處理10 min，取上清分裝保存(-80 ℃)．

1.7 Lrrc10多克隆抗體的檢測

收獲免疫兔血清，用小鼠心臟組織蛋白進行Lrrc10抗體的效價測定，設置抗體稀釋濃度分別為1∶50和1∶100．根據效價測定后的結果進行抗體特異性檢測，提取小鼠多組織蛋白，進行SDS電泳和免疫印跡分析．Lrrc10抗體以1∶100用1×封閉液稀釋．

2 結果

A:EcoRⅠ/SalⅠ雙酶切結果;B:pGEX-4T-1-Lrrc10質粒示意圖圖1 雙酶切鑒定及pGEX-4T-1-Lrrc10質粒示意圖

2.1 Lrrc10基因表達載體的構建

用第二對引物擴增得到Lrrc10基因部分序列(第628個堿基到927個堿基)，將該目的片段克隆到一級載體pMD18-T，通過雙酶切質粒pMD18-T-Lrrc10獲得目的片段后連入線性化的pGEX-4T-1載體，轉入DH5α感受態細胞．雙酶切鑒定(如圖1A)及測序分析顯示已成功構建了質粒pGEX-4T-1-Lrrc10 (圖1B)．

2.2 Lrrc10融合蛋白的表達及純化

將重組子轉化入BL21感受態細胞，用0.2 mol/L的IPTG在25 ℃條件下進行誘導，1、2、3、4、5、6 h各取1 mL菌液進行檢測，可見一條相對分子質量約為37 000大小的特異性條帶，與預期的GST-Lrrc10相對分子質量一致(如圖2)．

1:pGEX-4T-1-Lrrc10 未誘導蛋白表達；2:0.2 mmol/L IPTG 誘導pGEX-4T-1-Lrrc10 蛋白表達1 h;3：0.2 mmol/L IPTG 誘導pGEX-4T-1-Lrrc10 蛋白表達2 h;4：0.2 mmol/L IPTG 誘導pGEX-4T-1-Lrrc10 蛋白表達3 h;5：0.2 mmol/L IPTG 誘導pGEX-4T-1-Lrrc10 蛋白表達4 h;6：0.2 mmol/L IPTG 誘導pGEX-4T-1-Lrrc10 蛋白表達5 h;7：0.2 mmol/L IPTG 誘導pGEX-4T-1-Lrrc10 蛋白表達6 h;M：#0671圖2 Lrrc10蛋白的原核表達

M，#0671；誘導蛋白，0.2 mmol/L IPTG 誘導pGEX-4T-1-lrrc10 5 h時蛋白；純化蛋白，谷胱甘肽瓊脂糖珠親和純化后蛋白圖3 融合蛋白GST-Lrrc10的純化圖

選定誘導的優化條件為，25 ℃ 下生長至OD600值為0.6～0.8，用0.2 mmol/L 的IPTG 誘導表達5 h時所得到的蛋白質量最多且為可溶蛋白，融合蛋白經谷胱甘肽瓊脂糖珠親和純化后，通過SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍染色后顯示目的條帶純度較高，可進行蛋白免疫(如圖3)．

2.3 免疫印記鑒定Lrrc10多克隆抗體

用自制的Lrrc10多克隆抗體作為一抗進行Western blot檢測，在GST-Lrrc10蛋白所在位置存在特異性條帶(如圖4)，說明此兔抗血清中含有Lrrc10的特異性抗體并且該抗體的特異性和敏感性均達到實驗需要．

2.4 Lrrc10在小鼠組織中表達檢測

提取小鼠成體心臟、肝臟、大腦、肺、腎、胃以及小腸等組織蛋白，用制備的多克隆抗體檢測這些組織中Lrrc10蛋白的表達情況．從Western blot 檢測結果發現，Lrrc10在心臟有較強而且特異性的表達，在腦中有微弱表達(如圖5)．

1：抗原為小鼠心臟蛋白，一抗為免疫前兔血清；2、3：抗原為純化蛋白，一抗比例分別為1∶50和1∶100；4、5：抗原為小鼠心臟蛋白，一抗比例分別為1∶50和1∶100圖4 Lrrc10 多克隆抗體Western-blotting鑒定

圖5 Lrrc10 在成年小鼠各個組織表達檢測

3 討論

作為LRR家族一員的Lrrc10蛋白含有4個LRR 保守結構域，LRR 結構域在蛋白質相互作用中起重要作用．眾多研究表明含有此結構域的蛋白質可參與多種生物過程，如信號轉導、細胞粘性、轉錄活性的調控、DNA 修復、激素受體作用以及免疫反應等[4-7]．LRR 家族的蛋白質還有更多功能等待研究．

在制備此抗體過程中，作者運用的是pGEX-4T-1載體[8-10]．運用pGEX表達載體時，存在一個難點，即必須保證其目的基因在上清中表達，此時產物(谷胱甘肽巰基轉移酶和目的基因的融合蛋白)才可用Glutathione SepharoseTM 4B珠子進行純化．為消除這一問題，可改用pET-28a表達載體．pET-28a載體與其他表達載體不同之處在于其C，N兩端均含編碼Histag標簽的蛋白序列，如一端有移碼突變，能保證目的蛋白仍帶有Histag標簽蛋白，并且不論目的蛋白在上清或沉淀表達，都可用Ni-IDA凝膠柱親和純化獲得有活性的目的蛋白．

本實驗中,作者通過構建原核表達載體pGEX-4T-1-Lrrc10獲得GST-Lrrc10蛋白．最終免疫新西蘭大白兔獲得了Lrrc10抗體．通過免疫印跡等方法證明制備的Lrrc10多克隆抗體能特異結合生物體內表達的Lrrc10蛋白． 因此,它為將來運用染色質免疫沉淀、免疫共沉淀、免疫組化等手段深入研究Lrrc10基因的功能奠定了基礎．

參考文獻：

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