一株嗜熱菌的分離、鑒定及海藻糖合成酶基因的克隆

王慧榮 韋宇拓,黃日波

(1.浙江省環(huán)境保護(hù)科學(xué)設(shè)計(jì)研究院,中國 杭州 310007；2. 廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，中國 南寧 530005；3.廣西科學(xué)院，中國 南寧 530003)

自從在水生棲熱菌里發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶，促進(jìn)了生物學(xué)發(fā)展和嗜熱酶的商業(yè)開發(fā)和應(yīng)用以后，人們不斷尋找新的嗜熱菌，不僅為了研究嗜熱菌的嗜熱機(jī)理，更多的是尋找有應(yīng)用價(jià)值的嗜熱酶．由于嗜熱酶有熱穩(wěn)定性和在高溫下有最佳活力的特點(diǎn)，在造紙工業(yè)、環(huán)護(hù)、能源利用、煙草業(yè)、石油開采、液體燃料的生產(chǎn)、生物轉(zhuǎn)化及抗生素生產(chǎn)等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用[1-2]．嗜熱酶的廣泛應(yīng)用促使人們不斷尋找新的嗜熱菌．海藻糖(trehalose)是細(xì)胞在不良環(huán)境中所產(chǎn)生的一種重要的抗逆應(yīng)激物，在環(huán)境脅迫條件下對(duì)生命體和生物活性物質(zhì)具有保護(hù)功能，在食品工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景[3]．雖然目前，已從ThermusaquaticusATCC33923、ThermusthermophilusHB8等多種嗜熱菌中克隆了海藻糖合成酶編碼基因(treS),并且進(jìn)行了異源表達(dá)[4-5]．但是嗜熱菌來源的海藻糖合成酶分子量一般較大，表達(dá)量不高，需要解決密碼子偏愛性等問題以提高在大腸桿菌中的表達(dá)量．由于海藻糖合成酶三維晶體結(jié)構(gòu)的研究還未見報(bào)道，缺乏足夠的數(shù)據(jù)詳細(xì)闡述它的催化機(jī)理，通過空間分子結(jié)構(gòu)的改造來改善酶學(xué)性質(zhì)的研究有一定的困難，目前亟需大量的關(guān)于海藻糖合成酶的序列、結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性等相關(guān)數(shù)據(jù)．

本文從廣西熱泉中分離到一株嗜熱菌，初步鑒定它為Thermusthermophilus，對(duì)該菌的海藻糖合成酶基因進(jìn)行了初步探索，為構(gòu)建高產(chǎn)海藻糖合成酶的工程菌提供理論基礎(chǔ)及重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)；另一方面，也進(jìn)一步豐富不同微生物中該酶基因序列和結(jié)構(gòu)方面的信息．

1 材料和方法

1.1 樣品采集與處理

從廣西賀州市西雞鎮(zhèn)80 ℃，pH為6.7，含鹽量2 g/L的熱泉中采集水樣和泥樣．水樣以12 000 r/min離心10 min，收集菌體；泥樣用泉水徹底懸浮后，以500 r/min離心2 min，去除大顆粒的雜質(zhì)，然后再用處理水樣的方式處理上清液富集菌體．

1.2 菌株、載體及試劑

大腸桿菌JM109由本實(shí)驗(yàn)室保存，PCR產(chǎn)物純化試劑盒和膠回收試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司，限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶，pMD 18-T vector購自寶生物工程(大連)有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純．

1.3 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基[6]:NaCl 1 g，MgCl2·6H2O 1 g，MgSO4·7H2O 0.15 g，CaCl20.23 g，KCl 0.5 g，KH2PO40.42 g，(NH4)2SO40.1 g，NaBr 0.05 g，SrCl2·6H2O 0.02 g，NaHCO31 g，Yeast extract 1 g，Tryptone 1 g，肉汁胨0.5 g，F(xiàn)eCl3(100 g/L) 10 mL，1 000×Vitamin Solution 10 mL，Trace element solution 1 mL，NaOH調(diào)pH值至7.0，1×105Pa 滅菌30 min．Vitamin Solution用0.45 μm濾膜過濾，固體培養(yǎng)基加20 g瓊脂．

1.4 嗜熱菌的分離與培養(yǎng)

取處理好的樣品直接涂布于固體培養(yǎng)基上，分別置于75 ℃和80 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌落長出后，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行劃線培養(yǎng)，分別置于85 ℃，86 ℃，87 ℃下培養(yǎng)24～48 h.篩選能在最高溫度下生長的菌，從而實(shí)現(xiàn)菌株的分離與純化．為防止溫度過高在培養(yǎng)過程中平板脫水干裂，在培養(yǎng)時(shí)將平板倒置放在一個(gè)10 L的玻璃器皿中，里面放置1杯水，每天定期打開玻璃器皿通氧．

1.5 形態(tài)觀察和培養(yǎng)條件

1.5.1 形態(tài)觀察 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)了24～48 h的單菌落，用電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，革蘭氏染色光學(xué)顯微鏡觀察．

1.5.2 培養(yǎng)溫度 接種一個(gè)單菌落到10 mL液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)使其OD600達(dá)到0.6～0.8時(shí)，以2%的接種量接種到100 mL，pH為7.0的液體培養(yǎng)基中，在220 r/min條件下，分別置于55、60、65、70、75、80、85 ℃下，每隔2 h取1.5 mL菌液測定OD600．

1.5.3 培養(yǎng)pH值 同樣以2%的接種量接種到100 mL, pH值分別為5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0的液體培養(yǎng)基中，70 ℃，220 r/min條件下，每隔2 h取1.5 mL菌液測定OD600．

1.5.4 NaCl濃度的測定 以2%的接種量接種到100 mL NaCl質(zhì)量濃度分別為0，4，8，10，12 g/L，pH值為7.0的液體培養(yǎng)基中，在75 ℃，220 r/min條件下培養(yǎng)．每隔2 h取1.5 mL菌液測定OD600．

1.6 G+C 物質(zhì)的量濃度和抗生素敏感性的測定

用溶解溫度(Tm)法[7],參照文獻(xiàn)[8] 的濃度進(jìn)行測定．

1.7 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增、序列測定和系統(tǒng)發(fā)育分析

取對(duì)數(shù)期的菌液，離心后收集菌體，CTAB法提取總DNA．依照細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增的通用引物：F27(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)，R1522(5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3)，以TTH總DNA為模板，PCR反應(yīng)條件：94 ℃變性4 min，94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，共25個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸6 min．PCR產(chǎn)物純化后連接到 pMD 18-T vector，經(jīng)過抽提質(zhì)粒和酶切驗(yàn)證酶連接產(chǎn)物正確，委托上海基康生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序．將得到的16S rRNA序列與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取與其同源性達(dá)到98%的相關(guān)序列．采用軟件ClustalX對(duì)所獲得的核苷酸序列進(jìn)行序列比對(duì)，用軟件MEGA4.1計(jì)算出序列的系統(tǒng)進(jìn)化距離，采用鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹．

1.8 treS基因的擴(kuò)增

根據(jù)GenBank中已公布的模式菌株ThermusthermophilusHB8的treS基因序列設(shè)計(jì)引物，引物1：5′- TGGTAAACCCGCTCCCACAG -3′，引物2：5′- TGCCTGGGCACGGAAAAGAA-3′．以TTH總DNA為模板，PCR條件為94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 2 min, 30個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min．PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后進(jìn)行膠回收，與pMD 18-T vector 4℃過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109，藍(lán)白斑篩選，篩選陽性克隆，菌落PCR檢測目的條帶，提取陽性菌的質(zhì)粒．酶切鑒定，測序由上海基康生物技術(shù)有限公司完成．

圖1 菌株TTH的電鏡照片(×10 000)

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)和培養(yǎng)特征

菌株TTH為革蘭氏陰性的桿狀細(xì)胞，大小為(0.4～0.6)μm×(3.0～4.5)μm，無鞭毛、芽孢．培養(yǎng)48 h的菌落呈圓形，中間稍有凸起，邊緣整齊，表面光滑，有光澤，淺黃色，不透明．電鏡照片見圖1．

2.2 溫度對(duì)TTH生長的影響

菌株TTH的生長溫度范圍是55 ℃～85 ℃，低于55 ℃，高于85 ℃都不生長，在55 ℃，85 ℃下生長極度貧乏，最適生長溫度是70 ℃左右，培養(yǎng)約12 h進(jìn)入穩(wěn)定期．結(jié)果見圖2．

2.3 pH對(duì)TTH生長的影響

菌株TTH生長pH值的范圍是5.0～9.0，在5.0，5.5和9.0下生長十分緩慢，低于5.0，高于9.0條件下不生長．最適的生長pH值為6.5～7.5，結(jié)果見圖3．

圖2 溫度對(duì)菌株TTH生長的影響

圖3 pH對(duì)菌株TTH生長的影響

圖4 NaCl質(zhì)量濃度對(duì)菌株TTH生長的影響

2.4 NaCl對(duì)TTH生長的影響

TTH菌株生長的NaCl質(zhì)量濃度范圍是0～12 g/L，在12 g/L NaCl濃度下生長貧乏，大于12 g/L NaCl不生長，最適的NaCl濃度是0～4 g/L．結(jié)果見圖4．

2.5 G+C物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)和抗生素敏感性

菌株TTH的G+C物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)為67.6%．參照文獻(xiàn)[9]，加氨芐青霉素、氯霉素到液體培養(yǎng)基中，使其終濃度為10 mg/L，70 ℃，24 h未見生長．在加了鏈霉素、卡那霉素的培養(yǎng)基中，鏈霉素、卡那霉素的終濃度在50 mg/L時(shí)，菌株都可以生長．四環(huán)素10 mg/L時(shí)不抑制生長，100 mg/L時(shí)可完全抑制生長．

2.6 以16S rRNA序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株TTH 16S rRNA全序列總共1 478個(gè)堿基，在GenBank登錄號(hào)為EU616794.1．將其序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比較，發(fā)現(xiàn)菌株TTH與多株棲熱菌屬(Thermus)的16S rRNA序列同源性高達(dá)98%，依據(jù)此結(jié)果，菌株可歸屬于棲熱菌屬(Thermus)．選擇BLAST比對(duì)結(jié)果中相似度最高的5條16S rRNA，利用ClustalX 1.8和 MEGA4.1軟件，采用鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹．圖5表明菌株TTH與Thermusthermophilus的3株菌在同一族上，其中與ThermusthermophilusXM、Thermusthermophilusit-1、Thermusthermophilus這3株菌的同源性高達(dá)98%，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征指標(biāo)測定及16S rRNA序列分析結(jié)果，確定菌株TTH是棲熱菌屬中的Thermusthemophilus．

圖5 菌株TTH的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

1: treS gene; M: DL2000 Marker圖6 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

2.7 treS基因的擴(kuò)增

以TTH的總DNA為模板，采用引物1和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增treS基因，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖6所示．

從圖6中可以看出PCR擴(kuò)增出了約1 200 bp的片段，將PCR產(chǎn)物與pMD 18-T vector連接后，轉(zhuǎn)化E.coliJM109，藍(lán)白斑篩選，菌落PCR和酶切驗(yàn)證正確后，對(duì)treS基因進(jìn)行測序，其結(jié)構(gòu)基因全長為1 250 bp，GenBank accession:GQ175175，測序結(jié)果在GenBank中Blast進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它與菌株ThermusthermophilusRQ-1，Thermuscaldophilus，ThermusthermophilusHB8，Thermusthermophilus的treS基因的同源性最高可達(dá)87%，作者克隆的該菌的treS基因有可能是海藻糖合成酶的同源基因，treS基因的獲得為TTH菌株完整的treS基因的克隆奠定了基礎(chǔ)．

3 討論

早在1971年日本人就從當(dāng)?shù)?5 ℃～85 ℃的熱泉中分離到了Thermusthemophilus，從此對(duì)該菌進(jìn)行了大量的研究，但是已知的Thermusthemophilus大多從海洋熱泉中分離得到，能夠耐鹽[10]．本文從陸地?zé)崛蟹蛛x的TTH菌株生長的NaCl質(zhì)量濃度范圍是0～12 g/L，在12 g/L NaCl濃度下生長貧乏，NaCl濃度大于12 g/L時(shí)不生長，最適的NaCl濃度是0～4 g/L．在Thermusthemophilus里有好氧菌和厭氧菌，菌株TTH是好氧菌，文獻(xiàn)中HB27只能在好氧條件下生長，HB8不僅可在好氧條件下生長，還能在硝酸鹽存在的條件下厭氧生長．與TTH硝酸鹽還原反應(yīng)陰性相一致，可見在自然界中存在多種不同的Thermusthemophilus菌株[11]．由此可以看出嗜熱微生物資源相當(dāng)豐富，還有很大的探索空間，篩選出更多的嗜熱菌不僅可以豐富嗜熱微生物資源，還為研究嗜熱菌機(jī)理提供了實(shí)驗(yàn)素材．

本實(shí)驗(yàn)室通過DNA Shuffling技術(shù)尋求新的耐高溫海藻糖合成酶基因的研究已經(jīng)多年，從已報(bào)道的Thermusthermophilus不同菌株中克隆了海藻糖合成酶基因[12]，但是從嗜熱菌TTH中克隆的treS基因與這些菌中存在的海藻糖合成酶基因還是有差異的，且測定的序列與已報(bào)道的ThermusthermophilusRQ-1，Thermuscaldophilus，ThermusthermophilusHB8，Thermusthermophilus的treS基因的同源性最高達(dá)87%，由此作者認(rèn)為Thermusthermophilus的treS基因序列既有保守性，又有在不同環(huán)境條件脅迫下產(chǎn)生的進(jìn)化差異性．對(duì)菌株TTH的treS基因序列進(jìn)行進(jìn)一步的分析，將會(huì)為理解該酶的作用機(jī)制，以及該酶在不同細(xì)菌中的進(jìn)化演變情況提供有價(jià)值的參考．

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