一鍋法制備聚鄰氨基酚-納米金-酶膜用于葡萄糖安培傳感

李鵬昊,傅迎春,王 婷,部麗娟,謝青季,姚守拙

(湖南師范大學化學生物學及中藥分析教育部重點實驗室，化學化工學院，中國 長沙 410081)

高效固定酶分子是研制安培型酶電極的關鍵步驟，而采用導電或絕緣聚合膜基質是有效固定酶分子的常用方法[1-6]，其中絕緣聚合膜常能更好地抑制抗壞血酸、尿酸等共存電活性物質的干擾[2, 5, 6]．化學聚合和電化學聚合法是兩種常用的原位固定酶的方法，前者更易實現更高的酶負載量和固定酶活性[5, 6]，而后者更易于精確控制膜厚．我們將化學聚合和電化學聚合法相結合，提出了一種原位化學預氧化并電聚合單體的方法，所制酶電極性能優異[7]．納米材料及其在分析化學中的應用近年來備受重視，包括納米復合材料在研制生物傳感器的應用[8, 9]．然而，采用簡便的一鍋法制備生物納米復合物的工作目前并不多見．

本文中，我們基于HAuCl4和鄰氨基酚(oAP)的化學反應及oAP的電聚合反應，在葡萄糖氧化酶(GOx)共存條件下，研制了電合成的聚鄰氨基酚(PoAP)-鄰氨基酚寡聚物(oAPO)-金納米顆粒(AuNPs)-GOx復合物酶膜，用于安培傳感分析葡萄糖，性能優異．采用電化學石英晶體微天平(EQCM)實時監測了酶電極制備過程．

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

所有電化學實驗均在CHI660電化學工作站(CH Instrument Co., USA)上進行．EQCM實驗采用HP4395A網絡/頻譜/阻抗分析儀(Agilent, USA)．采用直徑12.5 mm的AT切9 MHz壓電石英晶體(北京晨晶電子有限公司)，雙面鍍金，實驗中單面觸液．直徑6 mm的金電極為工作電極，參比電極為飽和KCl甘汞電極(SCE)，對電極為碳棒．采用Pico Scan 5型(Agilent，USA)原子力顯微鏡．

GOx(EC 1.1.3.4; Ⅱ型，源自黑曲霉菌，活性均為150 kU·g-1)購自Roche公司 (Japan)，葡萄糖購自上海化學試劑公司．oAP購自廣東臺山化工廠．磷酸緩沖溶液 (PBS，pH 7.0) 配比為0.1 mol·L-1K2HPO4/KH2PO4+ 0.1 mol·L-1K2SO4．實驗中使用的所有化學試劑均為分析純或更高純度．使用的水為Milli-Q超純水(電阻率≥18 MΩ·cm)．

1.2 實驗步驟

金工作電極經化學和電化學處理．電極表面先滴加濃硫酸和雙氧水的混合液(vH2SO4∶vH2O2=3∶1)清洗，再在0.2 mol·L-1HC1O4水溶液中進行電位環掃(電位區間0 ～ 1.5 V vs.SCE，掃速30 mV·s-1)，直至循環伏安曲線重現．

在1 mL含15 mmol·L-1oAP的除氧PBS溶液中，加入1 mg GOx，攪拌溶液，緩慢加入40 μL 10 mmol·L-1HAuCl4(或12 μL 0.1 mmol·L-1K3Fe(CN)6)化學氧化劑，單體氧化后可得到短鏈寡聚物和少量長鏈聚合物(以下統稱為寡聚物)[7, 10]并包埋AuNPs和GOx，得到oAPO-AuNPs-GOx納米復合物懸濁液．將處理后的金電極浸入上述懸濁液中，電位環掃(0 ～ 1.2 V，掃速30 mV·s-1)，得PoAP-oAPO-AuNPs-GOx(或PoAP-oAPO-GOx-K3Fe(CN)6)酶膜．采用EQCM監測過程．電極水洗后，存于PBS緩沖液中備用．基于常規電聚合方法的酶膜(PoAP-GOx)制備類似，但無HAuCl4或K3Fe(CN)6．所制酶電極儲存于PBS中備用(4 ℃冰箱)．

酶電極檢測采用三電極系統，將酶電極置于10 mL pH 7.0的PBS緩沖液中，在0.7 VvsSCE恒電位下，檢測葡萄糖溶液加入前后的穩態陽極電流變化(對應于酶生H2O2的電氧化)．所有實驗均在室溫下進行．

2 結果與討論

2.1 酶電極的制備及表征

圖1為oAPO-AuNPs-GOx懸濁液的電聚合響應圖．可見，過量的oAP單體在0.04 V開始氧化，而在0.2 V出現了頻率的下降，表明oAPO-AuNPs-GOx和PoAP在電極表面開始共沉積．因為PoAP膜的絕緣性，電流和頻率響應逐圈顯著下降．三圈后，總頻率下降約3800 Hz，而動態電阻上升了約25 Ω，-Δf0/ΔR1=152 Hz·Ω-1，明顯大于粘密度效應特征值10 Hz·Ω-1[2, 11-13]，表明該聚合膜高度剛性．圖2為酶膜的原子力顯微鏡(AFM)圖，可見膜粗糙多孔，顆粒直徑約90 nm．

我們對酶電極制備及檢測條件進行了優化(圖略)．當膜厚為3 800 Hz時，酶電極的電流響應最大．因實驗條件下oAP的最大可溶解濃度約15 mmol·L-1，故采用此濃度實驗．實驗中采用0.4 mmol·L-1的HAuCl4濃度，因為HAuCl4濃度過低，不利于化學聚合反應的發生和酶的包埋，過高則易產生納米金和聚合物沉淀．此時HAuCl4的質量分數為0.016%，而Frens法所用HAuCl4質量分數0.01%基本一致[14]．實驗中選擇GOx濃度為1 g·L-1，過低會影響酶的固定效率，過高則抑制聚合反應．選擇酶電極的工作電位為0.7 V和檢測溶液pH值為7.0，與文獻報道結果[2, 3, 7]一致．

圖1 在含15 mmol·L-1 oAP, 1 g·L-1 GOx和0.4 mmol·L-1 HAuCl4的PBS溶液中電流、頻率和阻抗隨電位環掃的響應曲線，掃速：10 mV·s-1

圖2 PoAP-oAPO-AuNPs-GOx修飾電極的AFM圖

2.2 酶電極性能

在最優條件下，分別制備了PoAP-GOx、PoAP-oAPO-GOx-K3Fe(CN)6以及PoAP-oAPO-AuNPs-GOx修飾電極并考察了酶電極對葡萄糖的響應性能(圖3及表1)．可見，PoAP-oAPO-AuNPs-GOx電極的靈敏度最高，分別是PoAP-oAPO-GOx-K3Fe(CN)6和PoAP-GOx電極的1.7倍和4.5倍，優于很多文獻報道的第一代GOx生物傳感器[1-3, 11, 13]．PoAP-oAPO-AuNPs-GOx酶電極的檢測下限比其余兩酶電極降低了一個數量級．PoAP-oAPO-AuNPs-GOx酶電極的優異性能可歸因于：(1)固定酶的高負載量和高活性；(2)納米金的導電能力和催化特性．

圖3 PoAP-GOx (1), PoAP-oAPO-GOx-K3Fe(CN)6 (2)和PoAP-oAPO-AuNPs-GOx (3)修飾電極對濃度遞增葡萄糖的電流響應(A)及工作曲線(B)．插圖為線性響應區間的工作曲線

電 極靈敏度/(μA mmol·L-1·cm-2)線性范圍/(mmol·L-1)檢測限/(μmol·L-1)PoAP-GOx9.80.002～1.609.4PoAP-oAPO-GOx-K3Fe(CN)626.40.005～1.531.5PoAP-oAPO-AuNPs-GOx44.00.005～1.530.3

考察了上述三種酶電極的抗干擾性能．0.1 mmol·L-1抗壞血酸和尿酸的加入對2 mmol·L-1葡萄糖的電流響應基本上無干擾(低于5%)．也考察了所制PoAP-oAPO-AuNPs-GOx酶電極的操作穩定性及儲存穩定性．連續10次測試2 mmol·L-1葡萄糖，電流響應的相對標準偏差在5%以內；連續50 d對酶電極進行了檢測，2 mmol·L-1葡萄糖的電流響應值保持在其最初響應的80%以上，表明該電極操作和儲存穩定性俱佳．

3 結論

本文所提出的納米復合物制備方法可高負載量和高活性地包埋酶，酶電極制備方法簡便、高效，酶電極性能優異，可望在生物傳感、生物材料和生物催化等領域進一步應用．

參考文獻：

[1] MCMAHON C P, ROCCHITTA G, SERRA P A,etal. Control of the oxygen dependence of an implantable polymer/enzyme composite biosensor for glutamate[J].Anal Chem, 2006, 78(7): 2352-2359.

[2] DENG C Y, LI M R, XIE Q J,etal. New glucose biosensor based on a poly(o-phenylendiamine)/glucose oxidase-glutaraldehyde/prussian blue/Au electrode with QCM monitoring of various electrode-surface modifications[J].Anal Chim Acta, 2006, 557(1-2): 85-94.

[3] PAN D W, CHEN J H, YAO S Z,etal. Amperometric glucose biosensor based on immobilization of glucose oxidase in electropolymerizedo-aminophenol film at copper-modified gold electrode[J].Sens Actuators B, 2005, 104(1): 68-74.

[4] ZHANG Z N, LIU H Y, DENG J Q,etal. A glucose biosensor based on immobilization of glucose oxidase in electropolymerizedo-aminophenol film on platinized glassy carbon electrode[J].Anal Chem, 1996, 68(9): 1632-1638.

[5] NJAGI J, ANDREESCU S. Stable enzyme biosensors based on chemically synthesized Au-polypyrrole nanocomposites[J].Biosens Bioelectron, 2007, 23(2): 168-175.

[6] COSNIER S, GONDRAN C, SENILLOU A,etal. Mesoporous TiO2films: new catalytic electrode materials for fabricating amperometric biosensors based on oxidases[J].Electroanalysis, 1997, 9(18): 1387-1392.

[7] FU Y C, CHEN C, XIE Q J,etal. Immobilization of enzymes through one-pot chemical preoxidation and electropolymerization of dithiols in enzyme-containing aqueous suspensions to develop biosensors with improved performance[J].Anal Chem, 2008, 80(15): 5829-5836.

[8] LIU Y G, FENG X M, SHEN J M,etal. Fabrication of a novel glucose biosensor based on a highly electroactive polystyrene/polyaniline/Au nanocomposite[J].J Phys Chem B, 2008, 112(30): 9237-9242.

[9] LIU Z, WANG J, XIE D,etal. Polyaniline-coated Fe3O4nanoparticle-carbon-nanotube composite and its application in electrochemical biosensing[J].Small, 2008, 4(4): 462-466.

[10] FU Y C, ZOU C, XIE Q J,etal, Highly sensitive glucose biosensor based on one-pot biochemical preoxidation and electropolymerization of 2,5-dimercapto-1,3,4-thiadiazole in glucose oxidase-containing aqueous suspension[J].J Phys Chem B, 2009, 113(5): 1332-1340.

[11] DENG C Y, LI M R, XIE Q J,etal. Construction as well as EQCM and SECM characterizations of a novel Nafion/glucose oxidase glutaraldehyde/poly(thionine)/Au enzyme electrode for glucose sensing[J].Sens Actuators B, 2007, 122(1): 148-157.

[12] FU Y C, XIE Q J, JIA X E,etal. Electrosynthesized poly(1,6-hexanedithiol) as a new immobilization matrix for Au-nanoparticles-enhanced piezoelectric immunosensing[J].J Electroanal Chem, 2007, 603(1): 96-106.

[13] LI M R, DENG C Y, XIE Q J,etal. Electrochemical quartz crystal impedance study on immobilization of glucose oxidase in a polymer grown from dopamine oxidation at an Au electrode for glucose sensing[J].Electrochim Acta, 2006, 51(25): 5478-5486.

[14] PANDEY P, SINGH S P, ARYA S K,etal. Application of thiolated gold nanoparticles for the enhancement of glucose oxidase activity[J].Langmuir, 2007, 23(6): 3333-3337.