糖基化反應對花生分離蛋白乳化性的影響*

曾茂茂，曲剛，陳潔，黃小林

1(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)2(益海-嘉里集團食品技術研究所，河北秦皇島，066206)

糖基化反應對花生分離蛋白乳化性的影響*

曾茂茂1，曲剛1，陳潔1，黃小林2

1(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)2(益海-嘉里集團食品技術研究所，河北秦皇島，066206)

為通過糖基化提高花生分離蛋白的乳化性，探討了接枝度、不同還原糖種類、反應溫度以及還原糖比例對花生分離蛋白乳化性的影響。結果表明:采用葡萄糖與花生分離蛋白反應所得產物的接枝度較麥芽糖高，即葡萄糖的反應性好于麥芽糖;采用葡萄糖與麥芽糖糖基化后花生分離蛋白的乳化性均得到提高，且葡萄糖所得乳化活性較高，而麥芽糖所得乳化穩定性較高;反應溫度高于花生分離蛋白的變性溫度(60℃)時，其乳化性反而降低;花生分離蛋白與糖的質量比為1∶2時比1∶1和1∶3更有利于改善蛋白質的乳化性;糖基化改性后，花生分離蛋白的乳化性接近于食品中常用的酪蛋白酸鈉。

糖基化反應，花生分離蛋白，乳化性

花生分離蛋白由于具有較高的營養價值及較低的價格，在食品工業中具有廣泛的應用［1］。花生分離蛋白的乳化性在相關的食品加工過程中具有重要作用［2］，然而，花生分離蛋白的乳化性與動物源性蛋白質如酪蛋白、肌纖維蛋白和蛋清蛋白等相比，仍然存在著較大的差距［3］。為了提高花生分離蛋白的乳化性，繼而拓寬其應用范圍，常采用改性的方法。蛋白質改性常用的方法有物理改性［1，3］、化學改性［4］和酶法改性［5］。其中，糖基化反應是食品加工和保藏過程中的一種常見反應［6］，通過糖基化反應制備蛋白質和糖的衍生物，發現蛋白質的糖基化衍生物的功能特性能夠得到有效的提高［7］。本文擬探尋糖基化反應條件對花生分離蛋白乳化性的影響，為采用糖基化反應提高其乳化性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

高溫花生粕，萊陽魯花集團;其余試劑購于國藥集團化學試劑有限公司。

DELTA320型酸度計、AB204－N型分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司;機械攪拌器、磁力攪拌器、高速乳化均質機，廣州儀科實驗儀器有限公司;TDL-5低速大容量離心機、TGL-16B高速離心機，上海安亭科學儀器廠;JZ7114型粉碎機，上海朝陽微電機廠;PowerPac Basic美國BIO-RAD公司;LGJ-10型冷凍干燥機，北京四環科學儀器廠;UV-2800H型紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 花生分離蛋白的提取

采用2次堿溶酸沉法從高溫花生粕中提取花生分離蛋白:參考Diftis等［8］的方法，將高溫花生粕用60℃的溫水浸泡(料液比為 1∶20(g∶mL))，勻漿處理，用pH值為10的稀堿溶液浸提2 h(60℃)，再離心10 min(3 000 r/min)去除不溶物。調節上清液到pH值為4.5，離心10 min(3 000 r/min)取沉淀物。將得到的沉淀物復溶［料液比為1∶8(g∶mL)］，調節到pH值為10，再離心10 min(3 000 r/min)，去除不溶物，調節上清液到pH值為4.5，離心10 min(3 000 r/min)，取沉淀物。將沉淀物冷凍干燥，得到高溫花生分離蛋白。

1.2.2 糖基化蛋白的制備

采用Diftis等［9］人的方法，稱取5.49 g高溫花生分離蛋白和10 g葡萄糖(10 g麥芽糖)，混合均勻后，溶于400 mL的蒸餾水中，攪拌，用NaOH調節pH值至8，定容到500 mL，得到蛋白質濃度為10 mg/mL的混合溶液。混合溶液轉移到燒杯中，將燒杯放置于60℃的水浴中加熱，每間隔30 min取樣20 mL，放入離心管中，并用冷水迅速冷卻后待測。

1.2.3 接枝度的測定

采用 Lertittikul等［10］人的方法，將 125 μL 的反應液與2.0 mL的0.21 mmol/L的磷酸緩沖液混合，pH值為8.2，加入1.0 mL 0.01%的TNBS，充分混合后，放到50℃的水浴中加熱30 min(避光)，用2.0 mL的0.1 mmol/L的亞硫酸鈉終止反應。混合物在室溫下放置15 min，空白為在相同操作條件下采用蒸餾水代替反應液。采用紫外可見分光光度計在420nm下測定吸光值。自由氨基含量根據L-亮氨酸含量的標準曲線來確定。

式中:C0，未反應時自由氨基的含量，Ct。反應時間t時的自由氨基含量。

1.2.4 乳化性的測定

采用 Ramirez-Suarez［11］等人的方法，取 10 mL 蛋白質反應液與2 mL大豆油混合，放入40 mL離心管中，在機械乳化機中乳化2 min(13 500 r/min)，將乳化液迅速倒入25 mL的小燒杯中。取樣點固定在離燒杯底部0.5 cm處，取50 μL的乳化液與10 mL 0.1%的SDS混合，在500nm處測定，用0.1%的SDS作為空白對照。

乳化活性(EAI)=2×2.303× A0×N/c×(1－Φ)×104

乳化穩定性(ESI)=(At/A0)×100

式中:N，釋倍數;c，乳化液形成前蛋白質水溶液中蛋白質濃度(g/mL)，Φ，乳化液中油的體積分數(L/L)。

1.2.5 數據統計分析

本實驗中所有的數據均為3次平行2次重復的結果，數據均以平均值±標準偏差(SD)表示。

2 結果與分析

2.1 糖基化反應對接枝度的影響

為了表征花生分離蛋白與不同糖的反應性，考察了花生分離蛋白與葡萄糖和麥芽糖反應后接枝度的變化(如圖1所示)。從圖1中可以看出，葡萄糖與花生分離蛋白的反應性好于麥芽糖，即單糖的反應性強于雙糖，推測可能是由于在相同質量的情況下，單糖的羰基含量更高，增加了氨基和羰基結合的幾率，更有利于反應的進行。據文獻報道一致［12］，在糖基化反應中，糖基的分子質量越大，反應的速度越慢，反應進行的程度越低，而分子質量越小，反應速度越快，反應量越大。

圖1 花生分離蛋白與葡萄糖和麥芽糖反應后接枝度的變化

2.2 不同還原糖對糖基化反應改善乳化性的影響

將花生分離蛋白分別與葡萄糖和麥芽糖在60℃水浴條件下進行反應，不同反應時間復合物的乳化活性和乳化穩定性分別如圖2(a)和圖2(b)所示。

由圖2可知，隨著糖基化反應時間的延長，乳化活性逐漸得到提高，當反應到一定程度后，乳化性達到最高，與前人的研究結果吻合［13－14］，如酪蛋白和半乳甘露聚糖反應24h時，乳化性得到很好的改善［15］，血漿蛋白與半乳甘露糖需要反應5 d才能達到理想的乳化效果［16］，魚精蛋白與半乳甘露糖的反應則需要更長的時間［17］。然而，復合物乳化活性增加的幅度不斷減小，甚至出現下降的現象，該結果亦與文獻報道［18］，即隨著反應時間的增加，復合物的乳化活性將經歷上升和下降2個過程，開始糖與蛋白質發生共價交聯，由于糖的親水性使復合物的表面活性增加，從而乳化性得到提高，但當反應達到一定程度后，其交聯程度越來越高，使復合物過于親水而失去界面活性，從而降低了產物的乳化性。對于復合物的乳化穩定性來說，相同反應時間下，麥芽糖與花生分離蛋白的糖基化產物的乳化穩定性比葡萄糖好，說明麥芽糖比葡萄糖更有利于改善蛋白質的乳化穩定性。

2.3 不同反應溫度對糖基化反應改善乳化性的影響

糖基化改性的目的是在蛋白質分子結構改變較小的情況下盡量增加蛋白質中親水性基團的數量，從而使蛋白質達到更好的親水親油性平衡［19］。所以糖基化反應條件的選擇，既要保證Amadori重排產物的生成，又要避免生成類黑素等高級反應產物［20］。從圖3中可以看出，花生分離蛋白在80℃的反應條件下其乳化活性和乳化穩定性均有不同程度的下降，可能是由于花生分離蛋白此時發生變性的緣故(花生分離蛋白的變性溫度為60℃)，文獻中亦大都采用在低于蛋白質本身的變性溫度條件下反應。

圖2 花生分離蛋白與葡萄糖和麥芽糖反應后的乳化活性(a)和乳化穩定性(b)

圖3 不同溫度條件下花生分離蛋白與葡萄糖反應后的乳化活性(a)和乳化穩定性(b)

2.4 不同還原糖比例對糖基化反應改善乳化性的影響

測定花生分離蛋白與葡萄糖的比例不同時復合物的乳化活性和乳化穩定性，分別如圖4(a)和圖4(b)所示，當蛋白質和還原糖的質量比為1∶2時，糖基化產物的乳化活性和乳化穩定性比1∶1時好，但是當蛋白質與還原糖的質量比為1∶3時，乳化活性和乳化穩定性先升高再逐漸降低。結果表明，蛋白質和還原糖的質量比直接影響糖基化反應的進程，與文獻結果吻合，如 Dickinson等［21］發現，β-乳球蛋白與糖苷在60℃下反應，質量比為1∶1和1∶3時乳球蛋白的乳化性均有不同程度的提高，但是，質量比為1∶3時形成的聚合物的分子質量更大，因此乳化穩定性不如質量比為1∶1時的情況。然而，Kim等人［22］研究發現，牛血清蛋白與半甘露聚糖在質量比1∶6時反應產物的乳化性好于質量比為 1∶3，1∶9，1∶12 和 1∶15 。由此可見，初始蛋白質和糖的質量比直接影響糖基化后蛋白質乳化性的改善。

圖4 不同比例的花生分離蛋白與葡萄糖反應后的乳化活性(a)和乳化穩定性(b)

2.5 改性后與不同來源蛋白質原料的乳化性比較

將糖基化反應改性后的花生分離蛋白的乳化活性和乳化穩定性與不同來源的蛋白質的乳化活性和乳化穩定性進行比較，結果如表1所示。

表1 各種蛋白質乳化性的比較

從表1中可以看出，花生分離蛋白改性后其乳化活性和乳化穩定性均好于目前國內市場上常見的幾種工業用大豆蛋白，并接近食品中常用的酪蛋白酸鈉。結果表明，采用糖基化改性，提高植物蛋白的功能性質具有較大的發展潛力和工業化價值。

3 結論

葡萄糖和麥芽糖與花生分離蛋白進行糖基化反應，隨著反應時間的延長，蛋白質的乳化性均有不同程度的改善。葡萄糖與花生分離蛋白的反應性好于麥芽糖，且反應溫度為60℃，蛋白質和糖的質量比為1∶2時，比蛋白質和糖的質量比為1∶1和1∶3時更有利于改善蛋白質的乳化性。另外，糖基化改性后的蛋白質的乳化性好于市場上幾種工業用大豆分離蛋白，并接近了食品中常用的酪蛋白酸鈉。因此，通過糖基化改性提高植物蛋白質的功能特性具有很大的發展潛力和工業價值。

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Effects of Glycation Reaction on the Emulsifying Properties of Peanut Protein Isolate

Zeng Mao-mao1，Qu Gang1，Chen Jie1，Huang Xiao-lin2
1(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)2(Food Technology Research Institute，Yihai-Kerry Oils ＆ Grains Group，Qinhuangdao 066206，China)

In order to improve the emulsifying property of peanut protein isolate by glycation reaction，the effects of grafting degree，different reducing sugar，reaction temperature and the ratio of peanut protein isolate to reducing sugar were investigated.The results demonstrated that the grafting degree of the glycation product from peanut protein isolate with glucose was better than that with maltose，which suggested that glucose activity was better than maltose;the emulsifying properties of peanut protein isolate were improved by glycation reaction with both glucose and maltose.Furthermore，glucose reaction showed better emulsion activity index of glycation，while maltose reaction showed better emulsion stability index;the emulsifying property decreased if the reaction temperature was higher than the de Glycation denaturation temperature of peanut protein isolate(60℃);the ratio of peanut protein isolate to sugar with 1∶2 was better than 1∶1 and 1∶3 on emulsifying property;after glycation modification，the emulsifying property of peanut protein isolate was similar to that of sodium caseinate.The work has provided information on improving plant protein emulsifying property by glycation method.

glycation reaction，peanut protein isolate，emulsifying property

博士，講師(陳潔教授為通訊作者)。

*973計劃前期研究專項(2010CB535014);食品科學與技術國家重點實驗室目標導向課題(SKLF-MB-200803);益海－嘉里集團食品技術研究所項目

2010－12－01，改回日期:2011－02－01