柯薩奇病毒B5河南分離株全基因組序列測(cè)定及分析*

黃學(xué)勇，許玉玲，李幸樂，晁 靈，陳豪敏，許汴利

河南省疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所鄭州 450016

△男，1971年10月生，博士，副主任醫(yī)師，研究方向:分子流行病學(xué)與傳染病預(yù)防控制，E-mail:hxyzzu@163.com

柯薩奇病毒B5河南分離株全基因組序列測(cè)定及分析*

黃學(xué)勇△，許玉玲，李幸樂，晁 靈，陳豪敏，許汴利

河南省疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所鄭州 450016

△男，1971年10月生，博士，副主任醫(yī)師，研究方向:分子流行病學(xué)與傳染病預(yù)防控制，E-mail:hxyzzu@163.com

柯薩奇病毒B5;全基因組序列;基因特征

目的:了解柯薩奇病毒B5(CoxB5)河南分離株全基因特征及與其他腸道病毒基因的關(guān)系。方法:采用RT-PCR擴(kuò)增全基因，采用DNAStar中的SeqMan拼接所測(cè)序列，BioEdit進(jìn)行同源性比較，Simplot進(jìn)行相似度分析。結(jié)果:CoxB5/Henan/2010基因組全長(zhǎng)7 401 bp。與原型株Faulkner相比，編碼區(qū)氨基酸同源性為95.6%，核苷酸同源性為79.9%，其中VP4-VP2核苷酸差異為17.8%～20.4%，VP1核苷酸差異為19.5%，P2、P3核苷酸差異分別為19.5%、21.7%。不同型別腸道病毒間VP4-VP2核苷酸差異為14.4%～34.9%，VP1核苷酸差異為18.3%～42.3%，P2、P3核苷酸差異為17.1%～21.0%、15.5%～22.6%。結(jié)論:與原型株相比，CoxB5/Henan/2010株編碼區(qū)發(fā)生沉默突變，其核苷酸變異并不影響氨基酸序列的變化;腸道病毒基因組各分區(qū)在進(jìn)化中不同步。

2010年4月，河南省平頂山市魯山縣暴發(fā)了一起以兒童發(fā)病為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，主要臨床表現(xiàn)為短暫的發(fā)熱、頭痛、咽痛、腹瀉和惡心、嘔吐，重者可出現(xiàn)腦膜刺激征、嗜睡，腦脊液中淋巴細(xì)胞異常增多，腦脊液培養(yǎng)無細(xì)菌病原體等特征。河南省疾病預(yù)防控制中心對(duì)部分臨床診斷病例采集了腦脊液、血清和糞便標(biāo)本，通過病原分離、腸道病毒VP1區(qū)通用引物擴(kuò)增和腸道病毒組合血清等方法鑒定為柯薩奇病毒 B5(coxsackie virus B5，CoxB5)。該研究進(jìn)一步進(jìn)行分離毒株的全基因組測(cè)序，并分析其基因組和分子流行學(xué)特征。

1 材料與方法

1.1 毒株來源 2010年4月河南省平頂山市出現(xiàn)了一起兒童病毒性腦炎暴發(fā)，采集部分住院患者的腦脊液、血清標(biāo)本和糞便標(biāo)本，熒光RT-PCR檢測(cè)排除EV71、CA16感染，經(jīng)人橫紋肌肉瘤細(xì)胞(RD)和人喉癌上皮細(xì)胞(HEp-2)分離病原，腸道病毒VP1區(qū)通用引物擴(kuò)增和腸道病毒組合血清鑒定為CoxB5，命名為CoxB5/Henan/2010。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 參考CoxB5病毒韓國(guó)分離株(登錄號(hào):AY875692.1)、瑞典分離株(登錄號(hào): AF114383.1)全基因組序列，利用生物學(xué)軟件DNAStar和Primer 5.0設(shè)計(jì)9對(duì)首位相互重疊、分段擴(kuò)增CoxB5全基因組序列的引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見表1。1.3 毒株的復(fù)蘇和基因組擴(kuò)增 從液氮中取出保藏CoxB5毒株的凍存管，放入約40℃的水浴中，輕輕振蕩，使其快速解凍，體積分?jǐn)?shù)75%乙醇擦拭凍存管口后，將解凍液移入無菌離心管中，加入2 mL DMEM完全培養(yǎng)基，1 000 r/min離心8 min，棄上清液，加入3 mL新鮮培養(yǎng)基，輕輕吹打，使其充分分散形成懸液，接種于RD;置于36℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)時(shí)，收集病毒細(xì)胞及其培養(yǎng)上清。用病毒基因組RNA提取試劑盒提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，95℃預(yù)變性4 min，然后按以下參數(shù)進(jìn)行35個(gè)循環(huán):94℃變性50 s，50℃退火45 s，72℃延伸50 s;然后72℃延伸10 min，取PCR產(chǎn)物5 μL在12 g/L瓊脂糖凝膠中電泳分析。將PCR陽(yáng)性產(chǎn)物純化后送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。

表1 PCR擴(kuò)增用引物序列

1.4 生物信息學(xué)分析 使用生物學(xué)軟件DNAStar 7.0對(duì)核苷酸序列進(jìn)行整理、拼接組裝及校對(duì)，得到CoxB5/Henan/2010全基因序列。從GenBank上選取全基因組及5’UTR、P1、P2及P3等各部分同源性都較高的腸道病毒基因序列作為研究對(duì)象，參考序列來源于GenBank。序列分析首先用MegAlign將所有參與比對(duì)序列對(duì)齊，BioEdit進(jìn)行同源性比較，Simplot 3.5.1進(jìn)行相似性分析。以CoxB5/Henan/2010株作為質(zhì)詢序列，采用200個(gè)核苷酸的滑動(dòng)窗口，以20個(gè)核苷酸的步伐從基因組5’端向3’端方向滑動(dòng)。用NJ法對(duì)每個(gè)序列片段組構(gòu)建進(jìn)化樹，用Kimura兩參數(shù)法計(jì)算進(jìn)化距離，設(shè)定核酸轉(zhuǎn)換/顛換比例為2.0。

2 結(jié)果

2.1 病毒基因組序列測(cè)定及基本特征 得到的覆蓋病毒分離株基因組全長(zhǎng)的9個(gè)片段拼接結(jié)果顯示，CoxB5/Henan/2010株全基因組長(zhǎng)度為7 401 bp，其中A占28.23%，G占24.85%，C占23.20%，T占23.72%。腺嘌呤核苷酸和胸腺嘧啶核苷酸豐富(A+T=51.95%)。從基因組的5’端開始有742個(gè)堿基的非編碼區(qū)(5’UTR)與Faulkner株相同。5’UTR之后為6 558 bp的編碼區(qū)，編碼含2 185個(gè)氨基酸的多聚蛋白，其后為101個(gè)堿基的3’UTR。與其他CoxB5毒株相比，CoxB5/Henan/2010在編碼區(qū)沒有核苷酸的缺失和插入。

CoxB5/Henan/2010(GenBank 收 錄 編 號(hào): HQ998851)是一條單股正鏈RNA，除3’末端的多聚腺嘌呤(PolyA)尾巴外，全長(zhǎng)7 401 bp。經(jīng)BLAST比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，所測(cè)得全基因序列與多種腸道病毒核苷酸同源性均在75%以上。其全基因序列分為3個(gè)區(qū):742 bp的5’非編碼區(qū)(5’UTR)，6 558 bp的編碼區(qū)(P1:743～3 295，P2:3 296～5 029，P3: 5 030～7 300)，編碼2 185個(gè)氨基酸的多聚蛋白; 101 bp的3’非編碼區(qū)(3’UTR)。

2.2 5’和3’非編碼區(qū) 與原型株Faulkner相比，3’UTR核苷酸同源性最高，為85.2%，5’UTR核苷酸同源性為82.6%;與韓國(guó)2005年分離出的CoxB5相比，5’UTR同源性最高，為88.6%，3’UTR核苷酸同源性為84.3%;不同型別間腸道病毒序列5’UTR核苷酸同源性為72.5%～88.6%，3’UTR核苷酸同源性為69.6%～85.2%。各型別間5’UTR區(qū)核苷酸序列比較保守。

2.3 編碼區(qū)特征 蛋白編碼區(qū)分為P1編碼區(qū)、P2編碼區(qū)和P3編碼區(qū)，分別編碼P1前體蛋白、P2前體蛋白和P3前體蛋白。在翻譯過程中P1前體蛋白進(jìn)一步被切割為VP4、VP2、VP3和VP1，P2前體蛋白被切割為2A、2B和2C，P3前體蛋白被切割為3A、3B、3C和3D。與原型株Faulkner相比，CoxB5/ Henan/2010整個(gè)編碼區(qū)氨基酸差異為4.4%;核苷酸差異為20.1%，其中VP4-VP2核苷酸差異為17.8%～20.4%，VP1核苷酸差異為19.5%，P2、P3核苷酸差異分別為19.5%、21.7%。腸道病毒不同型別間序列 VP4-VP2核苷酸差異為14.4% ～34.9%，VP1核苷酸差異為18.3%～42.3%;P2、P3核苷酸差異為17.1%～21.0%、15.5%～22.6% (表2)。由Simplot圖(圖1)可以看出腸道病毒組內(nèi)UTRs與非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)(P2，P3)相似度遠(yuǎn)大于衣殼蛋白(VP4-VP2，VP1)編碼基因。

表2 CoxB5/Henan/2010株與其他腸道病毒同源性比較結(jié)果 %

圖1 CoxB5/Henan/2010株與其他腸道病毒相似度分析Simplot圖5’UTRs:1～742;P1:743～3 295;P2:3 296～5 029;P3:5 030～7 300。

3 討論

腸道病毒基因組中以衣殼蛋白 VP1、VP2和VP3編碼區(qū)較易發(fā)生變異，其中VP1蛋白上關(guān)鍵的抗原表位變化會(huì)影響病毒對(duì)宿主細(xì)胞的吸附及其免疫原性，從而改變病毒的毒力［1］。有研究［2］表明:目前基因重組已成為腸道病毒進(jìn)化的主要機(jī)制，基因重組不僅僅發(fā)生在衣殼區(qū)，P2、P3區(qū)基因重組也很頻繁。所以僅測(cè)定VP1區(qū)無法具體闡述腸道病毒的演變。

CoxB5作為一種腸道病毒，其感染與多種疾病有關(guān)，引起的最常見人類疾病為心肌炎、無菌性腦炎、手足口病等［3-4］。全球每年都有數(shù)起CoxB5流行的報(bào)道［5］。近年來，國(guó)內(nèi)安徽、河南、山東等地也發(fā)現(xiàn)多起CoxB5引起的疾病暴發(fā)［3-4，6］。

該研究通過對(duì)河南分離出的CoxB5全基因序列同源性及相似度等分析發(fā)現(xiàn)，腸道病毒型內(nèi)編碼區(qū)變異為沉默突變，其核苷酸變化并不影響到氨基酸的變化，型間編碼區(qū)氨基酸差異較大;P2和P3區(qū)均比較保守，氨基酸變異小，不同型別間P1區(qū)核苷酸變異最大，相似度較低，極可能是其在進(jìn)化過程中發(fā)生了非同義突變;可以推測(cè)P1、P2和P3的進(jìn)化并不同步。

隨著腸道病毒引起疾病譜的增多，基因序列也在不斷發(fā)生變異與重組，這就要求把加強(qiáng)對(duì)腸道病毒的監(jiān)測(cè)作為目前疾病預(yù)防工作的重中之重，全面做好其監(jiān)測(cè)及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作，以便進(jìn)行更好的預(yù)防及控制。

［1］Oberste MS，Maher K，Pallansch MA.Evidence for frequent recombination within species human enterovirus B based on complete genomic sequences of all thirty-seven serotypes［J］.J Virol，2004，78(2):855

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Analysis of genomic characteristics of coxsackie virus B5 strains isolated from Henan province

HUANG Xueyong，XU Yuling，LI Xingle，CHAO Ling，CHEN Haomin，XU BianliDepartment of Infectious Disease Control and Prevention，Henan Provincial Center for Disease Control and Prevention，Zhengzhou 450016

coxsackie virus B5;complete genome;genomic characteristics

Aim:To reveal the genomic sequence characteristic of coxsackie virus B5(CoxB5)and its relationship with other enterovirus gene.Methods:The whole genome sequence was sequenced by RT-PCR，and BioEdit and Simplotwere used to analyze the homology and similarity.Results:The full length of CoxB5/Henan/2010 genome was 7 401 bp.Compared with the prototype strain Faulkner，the entire coding region of amino acid homology was 95.6%，and VP4-VP2 nucleotide difference was 17.8%～20.4%，VP1 nucleotide difference was 19.5%，and P2，P3 nucleotide differences were 19.5%，21.7%.VP4-VP2 displayed 14.4% ～34.9%，VP1 displayed 18.3% ～42.3%and P2，P3 displayed 17.1%～21.0%，15.5%～22.6%in nucleotide difference compared with the other enterovirus，respectively.Conclusion:Compared with the prototype strain，CoxB5/Henan/2010 coding sequence is silent mutation，the nucleotide variation does not affect amino acid sequence changes.The genome evolution is not sync in the district of enterovirus.

R373.2+3

*河南省醫(yī)學(xué)科技重大攻關(guān)基金資助項(xiàng)目 201001015

(2011-03-20收稿 責(zé)任編輯姜春霞)