佛手GRAS基因的克隆及表達(dá)分析*

石 瑞， 曹詣斌， 陳文榮， 郭衛(wèi)東

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華 321004)

GRAS蛋白家族是高等植物所特有的具有高度保守羧基末端的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子家族，長(zhǎng)度在400～700個(gè)氨基酸，1999年首次被命名，GRAS取于最早被發(fā)現(xiàn)的3個(gè)功能成員GAI，RGA與SCR［1］．目前，在煙草、大豆、蓖麻、擬南芥、楊樹等植物中都有發(fā)現(xiàn)．從擬南芥基因組中鑒定了33個(gè)GRAS家族基因，被分為7個(gè)分支，分別是DELLA蛋白分支、SCR分支、Ls分支、HAM分支、PAT1分支、SHR分支和SCL9分支［2］．它們?cè)谥参镄盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、激素調(diào)節(jié)及分生組織的保持中起關(guān)鍵性作用［3］．GRAS 家族具有轉(zhuǎn)錄因子活性［1］，參與了植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和發(fā)育過(guò)程．已報(bào)道的GRAS家族基因包括控制植物根部徑向細(xì)胞分裂的SHR和SCR1、參與赤霉素激素信號(hào)途徑的GAI1和RGA1和參與光信號(hào)途徑的 PAT1和 SCL13［3-7］．Achard等［8］證明，擬南芥依賴CBF1的冷誘導(dǎo)信號(hào)途徑能夠通過(guò)影響赤霉素(GA)的代謝來(lái)調(diào)節(jié)抑制蛋白DELLA的積累，而DELLA蛋白通過(guò)有別于CBF誘導(dǎo)的低溫調(diào)節(jié)機(jī)制大大地促進(jìn)了CBF1誘導(dǎo)的冷馴化和抗凍性作用．DELLA蛋白在整合體內(nèi)信號(hào)和逆境信號(hào)進(jìn)而調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育方面起著關(guān)鍵的作用［9］．

佛手(Citrus medica var．sarcodactylis Swingle)是浙江、廣東、廣西、四川、福建等地重要的特色經(jīng)濟(jì)樹種，在浙江以金華的“金佛手”最為著名，樹體矮小并適合作觀賞盆景［10］．但是，佛手抗寒性差，低溫對(duì)佛手的影響非常嚴(yán)重．因此，對(duì)佛手抗逆機(jī)理的研究及其抗逆新品種的培育顯得越來(lái)越緊迫．郭衛(wèi)東等［11］從佛手半致死溫度入手對(duì)其抗寒性生理生化指標(biāo)進(jìn)行了研究．佛手常規(guī)雜交育種的難度很大，因此需要挖掘其自身抗低溫逆境的基因，研究其分子作用機(jī)理，并通過(guò)操作這類基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)佛手對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)．

筆者用抑制消減雜交方法從佛手中篩選得到了與低溫相關(guān)的一段表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)片段，結(jié)合RACE技術(shù)克隆得到該基因的全長(zhǎng)序列，對(duì)該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，顯示該基因具有GRAS保守結(jié)構(gòu)域，并對(duì)該基因在不同時(shí)間低溫脅迫下的表達(dá)特性進(jìn)行了研究．

1 材料與方法

1．1 材料

選用的材料為長(zhǎng)勢(shì)一致的兩年生浙江金華佛手品種“青皮”(C．medica cv．'Qingpi')的盆栽苗［10］．

1．2 處理

在人工氣候室進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，溫度設(shè)置參照劉祖祺等［12］的方法，預(yù)培養(yǎng)溫度為夜間20℃/白天28 ℃，光照每天14 h，光照強(qiáng)度為1 234．6 lx，濕度為75%，定期澆水．預(yù)培養(yǎng)3周后在2 d內(nèi)將溫度緩慢降至4℃進(jìn)行冷鍛煉7 d．在4℃下設(shè)置不同處理時(shí)間為0，12，24，36，48 h，0 h 為對(duì)照，取樣進(jìn)行分析，單株重復(fù)3次．

1．3 RNA的提取與第一鏈cDNA的合成

對(duì)來(lái)自佛手的10株植株的對(duì)照組與處理組(4℃培養(yǎng)12，24，36，48 h)的存儲(chǔ)葉片采用 Trizol方法進(jìn)行RNA提取，RNA第一鏈cDNA的合成使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶cDNA試劑盒(TAKARA)，其合成的cDNA作為GRAS基因克隆與實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(real-time quantitative PCR，qRT-qPCR)的模板．

1．4 RACE方法對(duì)佛手GRAS基因的克隆

根據(jù)已獲得的佛手EST片段，與美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中與佛手EST同源性高的楊樹、蓖麻、擬南芥的GRAS基因序列進(jìn)行比對(duì)拼接，使用ClustalW2進(jìn)行多序列比對(duì)，并通過(guò) Oligo6，Primer Premier等設(shè)計(jì)引物 5(見表1)．以佛手葉片組織的單鏈cDNA為模板進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增．反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性;94℃，30 s;50℃，30 s;72 ℃，30 s．電泳檢測(cè)目的基因的存在．通過(guò)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)對(duì)單鏈cDNA進(jìn)行5'加尾反應(yīng)，加尾后引入錨定引物QT進(jìn)行錨定PCR．為了防止非特異性條帶的產(chǎn)生，實(shí)驗(yàn)采用多組巢式引物(nested primer，見表1)進(jìn)行多輪巢式擴(kuò)增，獲得GRAS基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)序列．將PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳割膠回收后連接到PMD18-T載體(TAKARA)，送往生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定．

1．5 同源性的生物信息學(xué)分析

應(yīng)用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中循環(huán)延遲分集(CDD)分析目的基因的保守結(jié)構(gòu)域;應(yīng)用ClustalW2，MEGA 4．1對(duì)目的基因與已知序列基因進(jìn)行多序列比對(duì)及進(jìn)化樹分析．

1．6 佛手GRAS基因在低溫脅迫下的表達(dá)

利用熒光定量PCR方法分析佛手GRAS基因在不同時(shí)間低溫脅迫下的表達(dá)．

4℃低溫條件下分別對(duì)佛手植株進(jìn)行0，12，24，36，48 h處理，以0 h為對(duì)照，提取佛手葉片的RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈為模板，佛手看家基因β-actin為內(nèi)參進(jìn)行熒光定量PCR分析．目的基因的引物為:GRAS 5':5'-ATGTCGCTCCACCCTCT-3';GRAS 3':5'-TACTGCCGCATTCCTCC-3'．內(nèi)參β-actin的引物為:β-actin 5':5'-TCATACGGTCGGCAATA-3'，β-actin 3':5'-AAAGCCAAGGCGGTGAA-3'．

表1 GRAS基因5'和3'RACE巢式PCR擴(kuò)增特異引物

使用ABI STEPONE熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR分析，采用20 μL反應(yīng)體系:SYBRTM Premix Ex Taq 10 μL，正反向引物(10 μmol/L)各0．4 μL，ROX Reference Dye 50x 0．4 μL，cDNA 模板1 μL，ddH2O 7．8 μL．反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃ 預(yù)變性30 s;PCR反應(yīng):94℃ 5 s，50℃ 35 s，總共40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)．以β-actin作為內(nèi)參，將一個(gè)cDNA樣品經(jīng)系列稀釋后作為標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)構(gòu)建相對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法求得待測(cè)樣品的相對(duì)表達(dá)量．

2 結(jié)果與分析

2．1 RNA的提取與第一鏈cDNA的合成

取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的總RNA溶液5 μL，在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，檢測(cè)RNA的質(zhì)量，結(jié)果見圖1．可以看到:實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的總RNA有3條帶，分別是28 S rRNA，18 S rRNA和5 S rRNA帶，并且28 S rRNA帶的亮度是18 S rRNA帶的2倍．實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明所提總RNA的完整性良好，沒有降解現(xiàn)象．利用看家基因actin作為內(nèi)參對(duì)合成的cDNA進(jìn)行PCR檢測(cè)．根據(jù)設(shè)計(jì)的actin引物，在53℃的退火溫度下可得到400 bp左右的PCR產(chǎn)物(見圖1)，說(shuō)明cDNA制備成功．

圖1 瓊脂糖凝膠電泳圖

2．2 序列分析

測(cè)序結(jié)果顯示:該cDNA包含1 669個(gè)堿基;序列比對(duì)和同源性分析表明該cDNA包含1 236 bp的開放閱讀框，編碼413個(gè)氨基酸(見圖2)．利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)佛手EST基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，表明該基因?qū)儆贕RAS家族基因(見圖3)，具有保守的GRAS結(jié)構(gòu)域，因此命名為CmsGRAS(GenBank登錄號(hào):JF440647)．

2．3 序列同源比對(duì)

Blastx分析該基因的氨基酸序列與擬南芥已發(fā)現(xiàn)的33個(gè)GRAS基因的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，采用MEGA 4．1軟件，以鄰近法(NJ)對(duì)佛手與擬南芥AtGRAS 1～33氨基酸序列繪制進(jìn)化樹，根據(jù)進(jìn)化樹的比對(duì)結(jié)果，顯示佛手GRAS基因與擬南芥AtSCL5，PAT1基因的氨基酸序列同源性較高，親緣關(guān)系較近(見圖4)．

圖2 佛手GRAS轉(zhuǎn)錄因子序列

圖3 佛手GRAS保守結(jié)構(gòu)域分析

2．4 GRAS基因低溫處理的定量PCR分析

定量PCR分析表明(見圖5):在4℃低溫處理后，GRAS基因的表達(dá)量隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，0 h時(shí)表達(dá)量最低，12 h時(shí)與對(duì)照差異不大，24 h時(shí)表達(dá)量較對(duì)照上升約7倍，36 h時(shí)表達(dá)量超過(guò)對(duì)照近10倍，達(dá)到最高．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該基因的表達(dá)受到低溫脅迫誘導(dǎo)，在36 h處理時(shí)間內(nèi)隨著低溫脅迫時(shí)間的增加，其表達(dá)量呈上升的趨勢(shì)，其表達(dá)量的增加可能與低溫脅迫應(yīng)答有關(guān)．

圖4 佛手和擬南芥的GRAS序列進(jìn)化樹

圖5 佛手在4℃寒冷脅迫下GRAS基因的熒光定量分析

3 討論

通過(guò)RACE方法從佛手中獲得一個(gè)GRAS基因，該基因具有GRAS蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域，與擬南芥中發(fā)現(xiàn)的33個(gè)已知GRAS基因序列比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)佛手的 GRAS氨基酸序列與擬南芥SCL5，PAT1基因同源性較高，因此推斷獲得的cDNA序列是佛手的GRAS基因．

采用低溫脅迫處理研究佛手GRAS基因在寒冷脅迫下的表達(dá)特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)佛手植株在4℃處理后，在較短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)了該基因的表達(dá)，并隨著脅迫時(shí)間的加長(zhǎng)其表達(dá)量有逐漸上升的趨勢(shì)，說(shuō)明該基因?qū)Φ蜏孛{迫能夠做出積極的反應(yīng)．

Bolle等［5］研究表明，PAT1 與 SCL1/5/13 為同源亞族，PAT1在擬南芥中可能參與光敏色素A信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑．文獻(xiàn)［13］將 SCL1/5/8/13/21和PAT1列為一個(gè)分支，稱為PAT1亞家族．郭華軍等［14］實(shí)驗(yàn)證實(shí) SCL5與 PAT1為一個(gè)分支，且SCL5能受到干旱和滲透脅迫誘導(dǎo)，并且其表達(dá)量在誘導(dǎo)處理時(shí)呈逐漸上升的趨勢(shì)，證實(shí)它與干旱滲透脅迫有關(guān)．而佛手在4℃處理36 h時(shí)GRAS的表達(dá)量增加近10倍，明顯高于對(duì)照，根據(jù)該基因?qū)Φ蜏靥幚砗筠D(zhuǎn)錄水平的反應(yīng)，推測(cè)它在佛手耐低溫上有一定的作用，可能參與佛手逆境適應(yīng)的調(diào)節(jié)．此結(jié)果為利用轉(zhuǎn)基因手段選育耐低溫的佛手新品種提供了理論依據(jù)．

［1］Pysh L D，Wysocka-Diller J W，Camilleri C，et al．The GRAS gene family in Arabidopsis:sequence characterization and basic expression analysis of the SCARECROW-LIKE genes［J］．Plant J，1999，18(1):111-119．

［2］Bolle C．The role of GRAS proteins in plant signal transduction and development［J］．Planta，2004，218(5):683-692．

［3］Di Laurenzio L，Wysocka-Diller J，Malamy J E，et al．The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root［J］．Cell，1996，86(3):423-433．

［4］Silverstone A L，Ciampaglio C N，Sun Taiping ．The Arabidopsis RGA gene encodes a transcriptional regulator repressing the gibberellin signal transduction pathway［J］．Plant Cell，1998，10(2):155-169．

［5］Bolle C，Koncz C，Chua N H．PAT1，a new member of the GRAS family，is involved in phytochrome A signal transduction［J］．Genes Dev，2000，14(10):1269-1278．

［6］Helariutta Y，F(xiàn)ukaki H，Wysocka-Diller J，et al．The SHORT-ROOT gene controls radial patterning of the Arabidopsis root through radial signaling［J］．Cell，2000，101(5):555-567．

［7］Torres-Galea P，Huang Lifang，Chua N H，et al．The GRAS protein SCL13 is a positive regulator of phytochrome-dependent red light signaling，but can also modulate phytochrome A responses［J］．Mol Genet Genomics，2006，276(1):13-30．

［8］Achard P，Gong F，Cheminant S，et al．The cold-inducible CBF1 factor-dependent signaling pathway modulates the accumulation of the growthrepressing DELLA proteins via its effect on gibberellin metabolism［J］．Plant Cell，2008，20(8):2117-2129．

［9］Achard P，Cheng H，De Grauwe L，et al．Integration of plant responses to environmentally activated phytohormonal signals［J］．Science，2006，311(5757):91-94．

［10］郭衛(wèi)東，路梅，周春麗，等．佛手137Cs-γ射線輻射效應(yīng)研究［J］．浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006(1):31-33．

［11］郭衛(wèi)東，張真真，蔣小韋，等．低溫脅迫下佛手半致死溫度測(cè)定和抗寒性分析［J］．園藝學(xué)報(bào)，2009，36(1):81-86．

［12］劉祖祺，張石誠(chéng)．植物抗性生理學(xué)［M］．北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1994:8-29．

［13］Lee M H，Kim B，Song S K，et al．Large-scale analysis of the GRAS gene family in Arabidopsis thaliana［J］．Plant Mol Biol，2008，67(6):659-670．

［14］郭華軍．?dāng)M南芥轉(zhuǎn)錄因子GRAS家族SCL15基因?qū)Ω珊得{迫的響應(yīng)分析［D］．楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)院，2009:7-14．