大豆幼苗根系抗氧化酶活性的耐酸、鋁研究＊

劉 鵬， 俞慧娜， 吳玉環， 徐根娣， 鄭艷萍， 周 菁

(1．浙江師范大學植物學實驗室，浙江金華 321004;2．杭州師范大學生命與環境科學學院，浙江杭州330036)

在我國，酸性土壤為紅壤，且面積較大．近年來，隨著酸雨的頻繁發生以及農業生產中生理酸性肥料的大量施用，使得土壤的酸化進一步加劇，土壤的富鋁化作用加強，鋁毒害成為酸性土壤或酸化土壤上作物生長最重要的限制因素［1］．土壤pH的變化對植物生長影響的研究報道不多［2-3］．因此，了解酸、鋁對植物的毒害對研究植物的耐鋁性具有重要的理論和實踐意義．鋁的溶解性在很大程度上取決于土壤pH，因此，維持植物根際周圍高pH值就能降低鋁的溶解性，從而減輕鋁毒害．有研究［4-6］指出，在相同pH下，改變溶液的鋁濃度可以使植物根系生長受到更明顯的抑制，根系活力和根系質膜透性也相應地受到影響．

大豆是我國的重要經濟作物，研究其生產中對鋁脅迫的防治具有重要的經濟意義．目前有關金屬離子脅迫對大豆抗氧化酶影響的研究報道比較多見，如:俞慧娜等［7］研究表明，一定濃度的錳可以提高大豆體內活性氧的清除和抗逆能力;鄭世英等［8］通過實驗發現，在低濃度的Cd2+脅迫下，野生大豆與栽培大豆幼苗葉片的3種抗氧化酶:過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)均高于對照組;徐心誠［9］的研究說明高濃度鉛降低了大豆幼苗中SOD的活性，對大豆的生長有抑制作用;王啟明［10］則對鉻脅迫下大豆抗氧化酶活性的變化進行了探究．

關于鋁對作物抗氧化酶活性影響的研究已開展了不少的工作，如對茶樹［11］、小麥［12］、薺菜［13］，以及部分野生草本植物等都已有相關報道［14］．而通過不同酸、鋁處理的探究工作較少見．李朝蘇等［15］通過測試與鋁脅迫直接有關的5個生理指標，研究了蕎麥對酸、鋁脅迫的生理響應;朱佳等［16］進一步報道了酸、鋁處理對蕎麥根系形態和體內抗氧化酶的影響．Boscolo等［17］通過對玉米不同酸、鋁處理，探究了玉米葉片中 POD，CAT和SOD活性的變化情況．以大豆為研究對象，目前的研究工作主要集中在不同濃度的鋁處理條件下的探究，如劉鵬等［18］報道了不同濃度鋁處理對大豆幼苗膜脂過氧化和體內保護系統的影響．而關于不同酸、鋁處理下大豆根系抗氧化酶系統活性變化的相關研究報道較少．本文采用水培實驗法，以2個大豆品種(浙春2號和029-289)為材料，通過不同濃度酸、鋁處理，研究了大豆根系的抗氧化物酶活性的變化，旨在為大豆的耐酸、鋁機理深入研究提供資料．

1 材料和方法

1．1 材料與處理

以鋁耐性品種浙春2號和敏感性品種029-289為材料進行水培實驗．選大小一致、健康飽滿的種子放入消毒過的砂土中萌發，當幼苗長至第1片真葉完全展開時，將其移入30 L的塑料箱中用1/2 Hoagland營養液培養，培養過程中每5 d更換1次營養液，用氣泵每天2次通氣，每次2 h．在營養液中培養到3小葉完全展開后，挑選根系長勢基本一致的大豆幼苗，移入0．5 mmol·L-1CaCl2溶液中適應(又稱洗根)12 h(黑暗條件下)，設置不同量的酸、鋁 (T1:0 mmol· L-1Al+pH 3;T2:0 mmol·L-1Al+pH 4;T3:0 mmol·L-1Al+pH 5;T4:0．5 mmol·L-1(13．5 mg·L-1)Al+pH 5;T5:1 mmol·L-1(27mg· L-1)Al+pH 5;T6:1 mmol·L-1Al+pH 3)處理2，4，6，12 和24 h 后，對各項指標進行測定，用0．1 mol·L-1HCl溶液和0．1 mol·L-1NaOH溶液每2 h調節1次pH值．

1．2 測定方法

蛋白質含量的測定采用考馬斯亮藍法［19］，用mg·g-1表示;SOD活性采用氮藍四唑光化學還原法(NBT)測定［19］，用 U·mg-1表示;POD 活性采用愈創木酚法［19］，以每 min內 A470變化0．01為1個酶活性單位;CAT活性的測定采用硫代硫酸鈉滴定法［19］，以1 min酶解1 mg H2O2為1個活力單位，用U·mg-1表示．每個處理重復3次．

2 結果與分析

2．1 酸、鋁對大豆根系可溶性蛋白質含量的影響

由圖1可知:隨著酸、鋁處理時間的增加，大豆根系可溶性蛋白質含量總體上呈現先增多后減少的趨勢，在6 h時達到最大值，之后逐漸減少，在24 h時達到最小值;無鋁(T1～T3)影響下，隨著pH值的升高，可溶性蛋白質含量先增多后減少，在T2處理下達到最大值，說明適當提高pH值可以增加大豆根系的可溶性蛋白質含量;在pH 5條件下，隨著Al3+濃度的增加(T3～T5)，大豆根系的可溶性蛋白質含量仍然先增加后減小，在0．5 mmol·L-1Al處理下達到最大;T6處理下大豆根系可溶性蛋白質含量達到各酸、鋁處理下的最小值．

圖1 酸、鋁處理對浙春2號和029-289大豆根系可溶性蛋白質含量的影響

2．2 酸、鋁對大豆根系SOD活性的影響

超氧化物歧化酶(SOD)的主要功能是催化超氧化物陰離子自由基O·-2發生歧化反應生成H2O2和O2，從而清除O·-2．因此，SOD活性是衡量植物受逆境脅迫大小的一個生理指標．由圖2可以發現:隨著處理時間的增加，大豆根系的SOD活性呈先上升后下降的變化趨勢，在6 h時達到最大值，之后又逐漸下降，在24 h時達到最小值;在無鋁(T1～T3)影響下，隨著pH值的升高，SOD活性先升高后降低，在T2處理下達到最大值;在pH 5條件下，隨著Al3+濃度的增加(T3～T5)，大豆根系的SOD活性發生變化，在T4處理下出現最大值，隨后逐漸下降;T6處理下大豆根系SOD活性達到各酸、鋁處理下的最小值，說明對大豆根系的傷害達到最大．

圖2 酸、鋁處理對浙春2號和029-289大豆根系超氧化物歧化酶活性的影響

2．3 酸、鋁對大豆根系POD活性的影響

由圖3可知:隨著酸、鋁處理時間的增加，大豆根系的過氧化物酶(POD)活性先上升后下降，在6 h時達到最大值，之后又逐漸下降，在24 h時達到最小值;在無鋁(T1～T3)影響下，隨著pH值的升高，POD活性先升高后降低，在T2處理下達到最大值;在pH 5條件下，隨著Al3+濃度的增加(T3～T5)，POD活性逐漸增加(029-289在6 h時除外);T6處理下大豆根系POD活性達到酸、鋁處理下的最小值，說明對大豆根系的傷害最大．

圖3 酸、鋁處理對浙春2號和029-289大豆根系過氧化物酶活性的影響

2．4 酸、鋁對大豆根系CAT活性的影響

過氧化氫酶(CAT)活性的變化與POD活性的變化大體相似．由圖4可以發現:隨著處理時間的增加，CAT活性呈現先上升后下降的變化趨勢，都在6 h時達到最大值，之后又逐漸下降，在24 h時達到最小值;在無鋁(T1～T3)影響下，隨著pH值的升高，CAT活性先升高后降低，在T2處理下達到最大值;在pH 5條件下，隨著Al3+濃度的增加(T3～T5)，大豆根系的CAT活性逐漸增加(029-289在4 h時和浙春2號在4 h和6 h時除外)．T6處理下大豆根系的CAT活性達到各酸、鋁處理下的最小值，說明對大豆根系的傷害達到最大，對植物的生長造成脅迫．

圖4 酸、鋁處理對浙春2號和029-289大豆根系過氧化氫酶活性的影響

3 討論

鋁是土壤中含量最多的金屬元素，約占地殼總質量的8%．在近中性土壤中，鋁不會對植物造成傷害，但在酸性環境中毒性較大的活性鋁便會從土壤中析出，對植物造成危害．酸性土壤中作物產量的下降和森林的毀滅都和鋁毒害有直接關系［20］．土壤中鋁的形態受pH的影響，隨著土壤的酸化，引起土壤中鹽基離子的淋失，促進活性鋁的釋放．一般認為pH＜5．5時就有活性鋁釋出．在pH 4．0～ 5．5，鋁 主 要 以 羥 基 鋁 如 Al(OH)2+，Al(OH)2+的形式存在;在pH 4．0以下，鋁主要以Al3+形式存在．鋁毒害已經成為生長在酸性土壤中植物的主要限制因素［21］．因此，研究酸、鋁對植物的作用具有實踐意義．

鋁對作物的毒害是通過根部將土壤溶液中的活性鋁吸收到植物體內產生的．所以抑制根的生長是鋁脅迫下植物出現的最早癥狀，這個癥狀對植物的影響以小時(h)變化，甚至在μmol/L鋁濃度下以分(min)變化［22］．有研究表明，pH對大豆鮮質量的影響在pH 3．5 ～4．5抑制程度大，pH ＞4．5 時抑制程度小，隨著pH下降，其根系生長受到抑制，雖未達到顯著性差異水平，但還是對植物的生長造成了阻礙［6］．也有研究［23］認為，在 pH ＞4 時，H+對根的傷害可以忽略．

關于鋁對植物根系的抑制時間問題一直以來都有不同的報道［20-21，24-28］，不同的作物對鋁的反應時間有差異．本實驗表明在酸、鋁處理2 h后就可對大豆根系的抗氧化酶系統有作用．造成植物根系鋁反應時間不同的原因，可能是由于植物鋁耐性的不同導致植物對鋁的敏感性不同，也有可能與鋁的處理濃度有關．本實驗中隨著酸、鋁處理時間的增加，大豆根系抗氧化酶活性和蛋白質含量都呈現先上升后下降的變化趨勢，浙春2號和029-289兩個品種都在6 h時達到最大值，之后又逐漸下降，在24 h時達到最小值．

鋁對大豆抗氧化酶系統影響的研究大都停留在對植物葉片和單一鋁作用下的研究，在酸性條件下對大豆根系的研究還未見報道．本研究中，隨著pH由高到低，酸性逐漸增強，大豆根系蛋白質含量、抗氧化酶系統的活性都是先升高后下降，在T2處理時達到最高值．一定的酸處理能增加植物蛋白質含量，這可能是大豆對酸脅迫逆境的一種適應性表現．大豆根部的SOD活性誘導升高，以清除脅迫時植物體內的過量O2．-，這是植物的一種應激反應．隨后SOD活性下降，表明該酶歧化O2．-的能力下降，導致組織中的O2．-積累．CAT是廣泛分布于植物組織中的細胞內H2O2的重要清除劑．本研究中大豆根系的CAT活性在T1處理下低于T3，表明清除H2O2的能力下降，將造成H2O2積累［29］．細胞內H2O2不能及時清除，可與過量的O-2生成毒性更強的—OH．活性氧可直接攻擊生物大分子，導致蛋白質、膜脂、DNA分子結構異常，使SOD和CAT等酶活性降低、細胞生理功能紊亂．POD對多種脅迫具有響應，能降解H2O2，參與植物細胞木質素合成、吲哚乙酸(IAA)降解［24，30］，在植物根組織中活性較高．本研究中，T2處理下大豆根系的POD活性有所增加，使組織清除H2O2的能力有所增強．

SOD對酸、鋁脅迫的種間敏感性順序為029-289＞浙春2號．POD和CAT的活性對Al脅迫均表現為先升后降，POD的種間敏感性順序為浙春2號＞029-289;高濃度Al對CAT具有明顯的抑制效應，CAT對Al脅迫的種間敏感性順序為浙春2號＞029-289．在酸、鋁長時間脅迫下，SOD對2種大豆體內活性氧的清除起到關鍵作用，可作為大豆抗鋁能力強弱的敏感生理指標，2種大豆中浙春2號的抗鋁能力最強，029-289次之．

在脅迫強度較輕、脅迫時間較短、脅迫速度緩慢時，SOD，CAT和POD的活性上升;在脅迫強度較大、脅迫時間較長、脅迫速度快時，SOD和CAT的活性下降．雙重脅迫下，導致SOD活性始終呈現下降趨勢，而CAT和POD的活性上升;CAT活性表現出雙峰變化或前期上升、后期下降的趨勢，此結果與盧少云等［31］的研究相同．

鋁的溶解性在很大程度上取決于土壤pH，因此，維持植物根際周圍高pH就能降低鋁的溶解性，從而減輕鋁毒害．本實驗在pH 5條件下研究了不同濃度鋁對大豆抗氧化酶活性的影響．可以看出，酸、鋁對大豆根系抗氧化酶活性的影響不同:隨著鋁濃度的升高，蛋白質含量和SOD活性先升高后下降，在T4處理下達到最大值，而POD和CAT活性則逐漸升高．表明大豆根系可以在鋁脅迫下通過POD活性升高與其他抗氧化酶一起來清除體內產生的活性氧，以減輕Al對植物的傷害．POD和CAT作為植物體內H2O2的清除劑［32］，隨著酸、鋁處理時間的增加，POD和CAT的活性隨著鋁濃度的變化逐漸上升，表明在酸、鋁處理下大豆根系對H2O2的清除效果較好．把T1和T6處理相比，可以看出，相同pH條件下改變鋁濃度，可以使大豆根系抗氧化酶系統受到更明顯的抑制，總蛋白質含量也相應地受到影響，2個大豆品種都受到了最大的傷害．細胞受到氧化脅迫，由此引起的氧化損傷能夠使植物的生理代謝紊亂、生長發育異常．

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