飲食限制58 d對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶及抗氧化能力的影響＊

邵鄰相， 李 姣， 徐玲玲， 張均平，來樹圓， 蔡舒君， 葉信哲

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華 321004)

饑餓是指食物供應(yīng)受到限制以至于斷絕，或食物攝入受到影響，使機(jī)體處于能量和營養(yǎng)素?cái)z入不足或缺乏的狀態(tài)．大量研究表明，饑餓可延長(zhǎng)多種動(dòng)物的壽命［1］，延緩或減少退行性疾病包括癌癥、糖尿病和神經(jīng)障礙等的發(fā)生［2］，改變動(dòng)物的能量代謝、免疫功能［3］、激素分泌［4］．由于自然的、社會(huì)經(jīng)濟(jì)的和病理的原因造成饑餓和營養(yǎng)不足依然是當(dāng)今世界面臨的一個(gè)現(xiàn)實(shí)問題．動(dòng)物為了生存，就需要改變生理機(jī)能和調(diào)整代謝過程，通過利用自身貯存的能量物質(zhì)提供能量．因此，對(duì)饑餓的研究日益成為人們關(guān)注的話題．另外，在神經(jīng)系統(tǒng)的損傷機(jī)制中，自由基起著重要的作用，有研究發(fā)現(xiàn)［5］，過多的自由基能引起神經(jīng)細(xì)胞膜和細(xì)胞器結(jié)構(gòu)改變和功能障礙．在神經(jīng)退行性疾病發(fā)生過程中，離子平衡紊亂和興奮性神經(jīng)毒性導(dǎo)致的過量自由基能促進(jìn)細(xì)胞死亡［6］，這說明腦的功能(包括學(xué)習(xí)記憶功能)與抗氧化功能存在一定的關(guān)系．本文以ICR小鼠為研究對(duì)象，通過檢測(cè)不同程度飲食限制(Dietary restriction，DR)下小鼠的行為及抗氧化能力的變化，探討了限食小鼠學(xué)習(xí)記憶與抗氧化能力的關(guān)系．

1 材料與方法

1．1 試劑與儀器

硫代巴比妥酸(TBA)，三氯乙酸(TCA)，鄰苯三酚，乙二胺四乙酸二鈉(EDTANa2·2H2O)．均為分析純，購自金華醫(yī)藥公司．

水迷宮行為分析系統(tǒng)(TSE System GmbH，德國);高速冷凍離心機(jī)(Sigma公司);紫外分光光度計(jì)(Biochrom英國)．

1．2 動(dòng)物分組與處理

健康ICR小鼠30只，清潔級(jí)，周齡12～13，由金華市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供．小鼠適應(yīng)1周后進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)．預(yù)實(shí)驗(yàn)中設(shè)置40%，60%和80%限食度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)40%和60%限食度之間沒有區(qū)分效應(yīng)，而80%限食度導(dǎo)致小鼠大量死亡．因此，選取40%限食度和60%～80%限食度之間1/3的限食水平，即66．7%限食度．實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明40%和66．7%限食水平下能表現(xiàn)出一定的區(qū)分效應(yīng)．預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，選取30只雄性小鼠隨機(jī)分為自由飲食組、40%DR組和66．7%DR組．每天定時(shí)限量喂食，自第1天開始每天按20%限量喂食逐級(jí)遞減，達(dá)到預(yù)設(shè)飲食限制度后，維持該飲食限制水平喂食58 d．飲食限制39 d后，陸續(xù)采用Y迷宮、開場(chǎng)行為、水迷宮分別檢測(cè)小鼠的學(xué)習(xí)記憶、自發(fā)活動(dòng)及空間識(shí)別能力．飲食限制58 d時(shí)處死小鼠，測(cè)定小鼠各器官的臟器系數(shù)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量．

1．3 開場(chǎng)行為觀測(cè)

開場(chǎng)行為檢測(cè)小鼠自發(fā)活動(dòng)［7］．觀察并記錄小鼠在3 min內(nèi)出現(xiàn)的以下指標(biāo):跑動(dòng)格數(shù)(同時(shí)記錄1 min內(nèi)的跑動(dòng)格數(shù))、大便粒數(shù)、理毛次數(shù)、理毛延時(shí)、理毛潛伏、扶壁次數(shù)、扶壁延遲、扶壁潛伏，以及站立延時(shí)、站立潛伏、站立次數(shù)．

1．4 學(xué)習(xí)記憶功能檢測(cè)

Y迷宮檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力［7］．以小鼠電擊后直接逃至安全區(qū)為正確反應(yīng)，進(jìn)入電擊區(qū)或返回起步區(qū)為錯(cuò)誤反應(yīng)．每只小鼠重復(fù)訓(xùn)練50次．學(xué)習(xí)訓(xùn)練24 h后檢測(cè)記憶力，每只小鼠檢測(cè)20次．

水迷宮檢測(cè)小鼠空間識(shí)別能力［7］．訓(xùn)練3 d，第4天進(jìn)行定位航行測(cè)試，記錄小鼠在控制區(qū)的游動(dòng)距離、訪問次數(shù)、經(jīng)歷時(shí)間、潛伏期，以及在平臺(tái)上的逗留時(shí)間．

1．5 臟器系數(shù)測(cè)定

小鼠稱質(zhì)量后處死，取甲狀腺、脾臟、肝臟、腦組織、睪丸和心臟，吸去臟器表面的血液及體液后稱質(zhì)量并記錄．

1．6 SOD活性和MDA含量測(cè)定

鄰苯三酚自氧化法［8］測(cè)定SOD活性．MDATBA比色法［8］測(cè)定MDA含量．

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS12．0軟件進(jìn)行結(jié)果的方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示．

2 結(jié)果

2．1 飲食限制對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

從圖1可以看出:自由飲食組小鼠的體質(zhì)量變化不大，40%DR組和66．7%DR組小鼠的體質(zhì)量都在限食13 d左右開始下降，到37 d左右有所恢復(fù)，但都比自由飲食組小鼠的體質(zhì)量輕，且66．7%DR組小鼠的體質(zhì)量降幅最大．

2．2 飲食限制對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響

由表1可以看出:與自由飲食組相比，40%DR組小鼠的各項(xiàng)行為指標(biāo)與自由飲食組的都相差不大，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而66．7%DR組小鼠在1 min和3 min內(nèi)的跑動(dòng)格數(shù)、3 min扶壁次數(shù)和扶壁延時(shí)與自由飲食組小鼠和40%DR組小鼠相比都顯著增加．實(shí)驗(yàn)各組小鼠在3 min內(nèi)的大便粒數(shù)、扶壁潛伏、理毛次數(shù)、理毛延時(shí)、理毛潛伏、站立次數(shù)、站立延時(shí)和站立潛伏均無明顯的變化．

圖1 飲食限制對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

表1 飲食限制對(duì)小鼠開場(chǎng)行為的影響(x±s)

2．3 飲食限制對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶及空間識(shí)別能力的影響

表2顯示:各組學(xué)習(xí)成績(jī)中，40%DR組小鼠顯著高于自由飲食組和66．7%DR組．與自由飲食組相比，66．7%DR組小鼠的記憶成績(jī)最低，而潛伏期最短．另外，自由飲食組小鼠的游動(dòng)距離最長(zhǎng)，而逗留時(shí)間最短．各組小鼠的訪問次數(shù)無明顯區(qū)別．

表2 飲食限制對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶及空間識(shí)別能力的影響(x±s)

2．4 飲食限制對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響

表3顯示:與自由飲食組比較，40%DR組和66．7%DR組小鼠各器官的臟器系數(shù)都有所增加．40%DR組小鼠的心臟、肝臟和脾臟的臟器系數(shù)相比自由飲食組和66．7%DR組最高，其中與自由飲食組相比，40%DR組小鼠的肝臟、腦和脾臟的臟器系數(shù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．05)．66．7%DR 組小鼠的腦、甲狀腺和睪丸的臟器系數(shù)在實(shí)驗(yàn)各組中最高，其中腦的臟器系數(shù)與自由飲食組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．05)．

表3 飲食限制對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響(x±s)

2．5 飲食限制對(duì)小鼠組織SOD活性的影響

表4顯示:與自由飲食組比較，40%DR組和66．7%DR組小鼠的心、肝、脾、腦、腎和睪丸組織的SOD活性沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但40%DR組和66．7%DR組小鼠的心、肝和腦的SOD活性相比自由飲食組有所下降，其中66．7%DR組小鼠脾臟的SOD活性相比自由飲食組最高．

2．6 飲食限制對(duì)小鼠組織MDA含量的影響

表5顯示:與自由飲食組比較，66．7%DR組小鼠的心、腎和腦中MDA含量最高，40%DR組小鼠的肝臟MDA含量相比自由飲食組和66．7%DR組為最高，而脾臟中MDA含量相比自由飲食組和66．7%DR組為最低．

表4 飲食限制對(duì)小鼠組織中SOD活性的影響(x±s)

表5 飲食限制對(duì)小鼠組織中MDA含量的影響(x±s)

3 討論

許多小型哺乳動(dòng)物的體質(zhì)量受食物質(zhì)量或者食物資源的影響［9］．若限食幅度較小，則動(dòng)物可以通過提高消化道的吸收率增加能量攝入，通過調(diào)整代謝率和活動(dòng)行為調(diào)節(jié)能量支出，從而維持能量平衡和體質(zhì)量穩(wěn)重．然而，隨限食程度的增加，動(dòng)物不能通過能量攝入和支出的調(diào)節(jié)來彌補(bǔ)限食或饑餓導(dǎo)致的食物缺乏，從而表現(xiàn)為體質(zhì)量降低［10］．有研究［11］顯示，動(dòng)物體質(zhì)量的變化也受限食程度的影響．在本實(shí)驗(yàn)中，限食小鼠體質(zhì)量先減少后慢慢恢復(fù)，但不能恢復(fù)到正常水平，且限食組小鼠體質(zhì)量的減幅與限食程度成正比．

開場(chǎng)行為中，動(dòng)物爬格子數(shù)反映其興奮性，站立貼壁次數(shù)反映其在新異環(huán)境中的自發(fā)活動(dòng)能力，理毛次數(shù)、理毛延時(shí)、理毛潛伏反映其對(duì)新環(huán)境的滿意程度，大小便次數(shù)、扶壁次數(shù)、扶壁延時(shí)、扶壁潛伏反映其緊張程度．在本實(shí)驗(yàn)中限食小鼠在新異環(huán)境中表現(xiàn)得很不安，而對(duì)探究行為和對(duì)新異環(huán)境的滿意程度沒有影響，由此我們可以認(rèn)為它們之間不存在必然的聯(lián)系．Y迷宮顯示40%限食使小鼠學(xué)習(xí)能力顯著升高，這與邵鄰相等［12］對(duì)饑餓脅迫小鼠的研究結(jié)果一致，但其記憶能力隨飲食限制程度的升高而減弱，這反應(yīng)出飲食限制對(duì)大腦思維和反應(yīng)產(chǎn)生了一定的制約作用．水迷宮顯示隨著限食程度的加深，空間識(shí)別的潛伏時(shí)間逐漸縮短，表明在一定范圍內(nèi)小鼠對(duì)控制區(qū)的空間識(shí)別能力隨著限食程度的增加而加強(qiáng)．

饑餓可使動(dòng)物產(chǎn)生全身性的器官衰竭，神經(jīng)內(nèi)分泌功能發(fā)生紊亂［13］．臟器系數(shù)是衡量動(dòng)物健康的重要指標(biāo)，依據(jù)臟器系數(shù)可大體確定動(dòng)物內(nèi)臟器官病變的性質(zhì)和程度［14］．本實(shí)驗(yàn)中40%DR組和66．7%DR組小鼠各器官的臟器系數(shù)相比自由飲食組都有所上升，且40%DR組小鼠的脾臟系數(shù)、肝臟系數(shù)顯著增大，說明40%飲食限制對(duì)小鼠脾臟和肝臟產(chǎn)生了一定程度的損傷，也提示饑餓對(duì)機(jī)體器官的損傷并不一定與饑餓程度成正比．

本實(shí)驗(yàn)顯示飲食限制對(duì)小鼠各組織中SOD活性沒有影響，但腦、腎和心中MDA含量隨飲食限制水平升高而增大，說明飲食限制使小鼠抗氧化能力有所下降，這與都麗萍等［15］對(duì)大鼠限制熱量的研究結(jié)果相一致．

從學(xué)習(xí)記憶與抗氧化能力的關(guān)系來看，本實(shí)驗(yàn)中限食小鼠腦中的SOD活性下降、MDA含量增加，說明限食小鼠腦中脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生增多，腦的抗氧化能力下降，但其學(xué)習(xí)能力及對(duì)空間的識(shí)別能力有所增加，而記憶能力有所減弱．這與石俊等［16］研究指出:動(dòng)物處于饑餓狀態(tài)一段時(shí)間以后可發(fā)生海馬細(xì)胞核DNA損傷及細(xì)胞死亡，從而造成學(xué)習(xí)記憶能力損害的結(jié)果不一致．這可能是饑餓程度與其所研究的饑餓水平不一樣所致．

綜上所述，飲食限制可引起機(jī)體一系列生理生化變化，在抗氧化能力及記憶能力上影響不顯著，但適度的限食能夠較顯著地提高小鼠的學(xué)習(xí)能力．當(dāng)然，飲食限制過度能對(duì)小鼠產(chǎn)生毒害作用，最終因耗竭或并發(fā)癥而死亡［17］．因此，何種程度的限食才是最適量的，有待進(jìn)一步研究．

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