徑向流色譜脫除靈芝多糖中蛋白質和色素的工藝優化＊

姜慧燕,孫培龍,邵平

1(杭州市農業科學研究院,浙江杭州,310024)2(浙江工業大學生物與環境工程學院,浙江杭州,310014)

徑向流色譜脫除靈芝多糖中蛋白質和色素的工藝優化＊

姜慧燕1,孫培龍2,邵平2

1(杭州市農業科學研究院,浙江杭州,310024)2(浙江工業大學生物與環境工程學院,浙江杭州,310014)

徑向流色譜是一種新型色譜分離純化技術,在生物工程領域具有很大的應用潛力。文中利用徑向流色譜法對靈芝粗多糖進行純化,以脫除其中的蛋白質和色素。通過單因素及響應面試驗,確定了純化過程的最優化條件:上樣流速 2 mL/min,洗脫流速 40 mL/min,上樣量 100 mL。在此條件下,蛋白脫除率、色素脫除率和多糖回收率分別達到 80.35%、88.52%、85.06%。徑向流色譜法與 Sevag法、三氯乙酸法、活性炭法及雙氧水法等傳統化學方法比較的結果表明:徑向流色譜脫蛋白、脫色及多糖保留效果均優于其他方法,且在處理過程中未使用有機試劑,突出了徑向流色譜法高效、經濟、安全、環保等優勢。

徑向流色譜,靈芝粗多糖,脫蛋白,脫色

徑向流色譜 (radial flow chromatography,RFC)是一種新型色譜分離純化技術,獨特的徑向流動設計,使其相對于傳統軸向色譜,具有流速高、樣品處理量大、操作壓力低、線性放大容易等優勢[1-5],在生物工程等諸多領域正發揮著越來越重要的作用,尤其是已被廣泛用于蛋白質[6-11]及基因工程[12-13]產品的分離純化方面。Gustavsson等[6]利用徑向流色譜從牛心臟粗提物中分離制得乳酸脫氫酶。Hou等[7]采用離子交換徑向流色譜對人血漿進行大規模分離制備,在數十分鐘內成功分離得到純度接近 100%的免疫球蛋白、純度為 85%的轉鐵蛋白和純度為 80%的白蛋白。Surinder等[11]利用徑向流色譜高效分離純化重組人類生長激素,處理時間較軸向色譜縮短 90%以上。Sun等[12]利用徑向離子交換色譜分離純化了Nitschmann組分Ⅲ中的凝血酶原復合物。張正光等[13]人用國產徑向陽離子交換柱從 CL-CD1細胞培養上清中分離純化尿激酶原,使尿激酶原比活性提高44.3倍,蛋白質含量下降 98%以上,回收率達87.7%。

通過熱水浸提等方法所得靈芝粗多糖中往往混雜著色素、蛋白質、低聚糖等雜質,需進一步分離純化,提高多糖純度,以達到相關產品原料的標準。本文旨在利用徑向流色譜純化靈芝粗多糖,以達到同時脫除其中蛋白質及色素的效果,并與粗多糖傳統的脫蛋白脫色方法進行系統地比較研究。

1 材料與方法

1.1 原料

靈芝粗多糖:純龍泉靈芝多糖,由浙江益圣菌物發展有限公司提供。

離子交換劑:弱堿性陰離子交換劑 (A103S),購于德清漂萊特 (中國)有限公司;強堿性陰離子交換劑 QA60,由美國 Sepragen公司提供。

1.2 主要儀器與試劑

徑向流色譜柱,SUPERFLO-250 COLUMN,美國Sepragen公司;752型紫外-可見分光光度計,上海光學儀器有限公司;紫外掃描儀,UV-2450PC,日本島津公司;恒流泵,BT00-300M,保定蘭格恒流泵有限公司;數控計滴自動部份收集器,SBS-100,上海康華生化儀器制造廠;Folin-酚試劑:北京鼎國生物技術有限責任公司;Sevag試劑:三氯甲烷與正丁醇按體積比 4∶1混合;三氯乙酸-正丁醇試劑,三氯乙酸與正丁醇按體積比 1∶10混合;三氯甲烷、正丁醇、硫酸、苯酚等試劑,均為國產分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 徑向流色譜純化靈芝粗多糖工藝流程

離子交換劑預處理:將離子交換劑 (A103S)置于2%NaOH溶液中浸泡 2～4 h,純水洗滌至中性,然后置于 3%HCl溶液中浸泡 2～4 h,純水洗滌至中性,最后再于 2%NaOH溶液浸泡 2～4 h,純水洗滌至中性。

將靈芝粗多糖粉加純凈水充分溶解 (10 mg/mL),于 4 900 r/min下離心,得靈芝粗多糖水溶液。將預處理后的離子交換劑裝填于徑向流色譜柱中,以純凈水沖洗平衡柱子。將一定量的靈芝粗多糖溶液用恒流泵于一定流速下上樣,然后用蒸餾水洗脫至苯酚-硫酸法[14-15]無多糖檢出,收集洗脫液,真空濃縮,冷凍干燥得靈芝多糖。

填料再生:使用過的填料,用 2 mol/L NaCl溶液洗脫,至洗脫液無色透明,并用 Folin-酚法[16]基本無蛋白檢出,再用蒸餾水洗脫至無 NaCl。

1.3.2 徑向流色譜純化靈芝粗多糖條件優化

通過單因素及響應面試驗,以蛋白脫除率、色素脫除率及多糖回收率為指標,對徑向流色譜純化靈芝粗多糖的工藝條件進行優化。單因素水平如表 1所示。在單因素試驗基礎上,進行響應面試驗,根據Box-Behnken中心設計原理,設計了 15個實驗點,其中 12個為析因點,3個為零點,共進行 3次,用以估計試驗誤差。每個實驗點重復 2次。試驗因素與水平見表 2。

表1 徑向流色譜純化靈芝粗多糖單因素試驗水平表

表2 響應面優化試驗因素水平及編碼

1.3.3 Sevag法脫蛋白

取 100 mL靈芝粗多糖液,按粗多糖液∶Sevag試劑體積比 3∶1加入 Sevag試劑,混合,分液漏斗中充分振搖 30 min,使蛋白質和 Sevag試劑生成凝膠物質分離,于 4 900 r/min下離心 10 min,棄去下層有機相及中間凝聚物,再向分離出的上層粗多糖溶液中加入Sevag試劑,重復操作數次,同時測定上清液中蛋白質及多糖含量。

1.3.4 三氯乙酸法 (TCA法)脫蛋白

取 100 mL靈芝粗多糖水溶液 (10 mg/mL),加入等體積的 20%三氯乙酸,攪拌 30 min,靜置 12 h,4 900 r/min離心 10 min,分出上清液,用 1 mol/L NaOH溶液調 pH值至 7,測上清液中蛋白質和多糖含量。

1.3.5 三氯乙酸-正丁醇法脫蛋白

取 50 mL靈芝粗多糖水溶液 (10 mg/mL),加入50 mL三氯乙酸-正丁醇試劑,于分液漏斗中充分振蕩 20 min后,靜置 3 h,取下清液棄去上清液及中間層凝聚物,同時測定下清液及靈芝粗多糖原液中蛋白質及多糖含量。

1.3.6 活性炭脫色

取 100 mL靈芝粗多糖水溶液 (10 mg/mL),置于錐形瓶中,加入 2.0%活化后的活性炭,將 pH值調至3.0,磁力攪拌 20 min,抽濾,所得濾液再經微濾后,于450 nm下測定濾液及靈芝粗多糖原液光密度值。

1.3.7 雙氧水脫色

取 100mL靈芝粗多糖水溶液 (10 mg/mL)于錐形瓶中,加入多糖液 1/3體積的 H2O2,50℃下靜置 5h后,于 450 nm下測定脫色前后靈芝粗多糖溶液光密度值,計算脫色率。

1.3.8 徑向流色譜與軸向色譜比較

分別測定流速為 5、10、20、30、40、50、100 mL/min時純水流經徑向流色譜和軸向色譜時的柱壓,填料為 QA60和 A103S。

比較徑向流色譜與軸向色譜對靈芝粗多糖的純化效果。色譜條件:上樣濃度 10 mg/mL,上樣量 100 mL,上樣流速 2 mL/min,洗脫流速 40 mL/min,自動部分收集器以 26 s/管的速度收集洗脫液。分別測定計算蛋白脫除率、色素脫除率和多糖回收率。

1.3.9 指標及分析檢測方法

以蛋白質脫除率、色素脫除率及多糖回收率為指標,衡量徑向流色譜法純化靈芝粗多糖的效果。各指標計算公式如下:

多糖含量測定采用苯酚-硫酸法:吸取樣品液 1 .0 mL,用水補至 2.0 mL,加入 1.0 mL 6%苯酚及 5.0 mL濃硫酸,振蕩混勻,置沸水浴中加熱 15 min,取出置冰水中迅速冷卻后,于 490 nm測吸光度,計算多糖含量。

蛋白質含量測定采用 Folin-酚法:吸取樣品液1.0 mL,加入 5 mL試劑甲,于漩渦混合器上迅速混勻,水浴 (30℃)10 min;再逐管加入 0.5 mL試劑乙,立即混勻,水浴 (30℃)30 min后,于 660 nm下測吸光度,計算蛋白質含量。

色素的測定采用分光光度計法測 450nm下多糖溶液脫色前后的吸光度。

2 結果與分析

2.1 上樣量對徑向流色譜純化靈芝粗多糖的影響

上樣量對徑向流色譜純化靈芝粗多糖的影響結果如圖 1所示。隨著上樣量的增大,色素脫除率的變化較為顯著,當上樣量超過 100 mL時,色素脫除率急劇下降,上樣量為 300 mL時,色素脫除率降至74.47%。蛋白脫除率隨上樣量增大的變化趨勢先是較為平緩,當上樣量超過 200 mL時,急劇下降。當上樣量為 300 mL時,蛋白脫除率降低至 64.46%。多糖回收率則隨上樣量的增大,總體呈緩慢上升的趨勢。當分離過程以蛋白質脫除為主要目的時,上樣量取 200 mL較為適宜。

圖 1 上樣量對徑向流色譜純化靈芝粗多糖的影響

2.2 上樣流速對徑向流色譜純化靈芝粗多糖的影響

上樣流速對徑向流色譜純化效果的影響,主要是對樣品組分交換吸附的影響。上樣流速過快,樣品溶質分子來不及擴散到離子交換劑表面,就隨流動相流出柱外,不利于蛋白質、色素等物質的吸附。徑向流色譜柱采用了徑向流動技術,樣品經流體分布器均勻分布后,從柱的外周流向柱圓心,使得樣品在上樣過程中能充分的與離子交換劑結合,即使在較高流速下,樣品仍能在柱內較好的擴散,從而得以充分地吸附到填料上。因此,即使上樣流速為 50 mL/min時,蛋白脫除率及色素脫除率仍分別可達 64.00%和68.32%(圖 2)。

圖 2 上樣流速對徑向流色譜純化靈芝粗多糖的影響

2.3 洗脫流速對徑向流色譜純化靈芝粗多糖的影響

由于色譜柱的表面積一般都大于其橫截面積,因此當徑向流色譜柱流動相保持較高體積流速時,其線速度也并不高。從圖 3可以看出,在洗脫流速較低時(<10 mL/min),蛋白脫除率和色素脫除率隨洗脫流速的增加有所增加,隨后趨于平緩;當洗脫流速大于30 mL/min時,蛋白脫除率和色素脫除率隨洗脫流速的增加下降較快。但即使洗脫流速高達 50 mL/min時,蛋白脫除率和色素脫除率仍分別能達 67.42%和85.88%。多糖回收率則隨洗脫流速的增加而呈緩慢上升趨勢。

圖 3 洗脫流速對徑向流色譜純化靈芝粗多糖的影響

2.4 徑向流色譜純化靈芝粗多糖響應面試驗結果

響應面試驗結果表明,色素脫除率變化趨勢與蛋白脫除率基本一致,而多糖回收率則與蛋白脫除率呈相反趨勢,因此只對其中蛋白脫除率進行分析。利用Matlab軟件對蛋白脫除率實驗數據進行回歸分析,得二元回歸方程:

方差分析得,方程決定系數 R2為 0.992 1,修正相關系數平方和為 0 .978 0,此模型高度顯著 ( P<0.0001),失擬項小,因而該模型擬合程度良好,表明試驗設計可靠 (表 3)。

表3 響應面模型方差分析結果

由回歸方程得出最高指標時各因素組合為:上樣流速 2.00 mL/min,洗脫流速 10.04 mL/min,上樣量100.00 mL/min,此時蛋白脫除率為 82.76%。而在實際生產中,考慮到生產效率的關系,宜選取較高的洗脫流速。且從洗脫流速及上樣流速的響應面圖分析可知,當上樣流速保持在 2 mL/min時,蛋白脫除率隨洗脫流速的增加先降低后有所增加。因此在實驗過程中,考察了上樣流速、洗脫流速、上樣量分別為 2 mL/min、40 mL/min、100 mL時的多糖純化效果。實驗所得結果為:蛋白脫除率 80.35%,色素脫除率88.52%,多糖回收率 85.06%,與優化條件下所得結果相差不多,但分離效率大大提高。

2.5 徑向流色譜法同各種化學方法脫蛋白脫色效果比較

徑向流色譜法同各種化學方法脫蛋白脫色效果的比較結果如表 4所示。Sevag法對靈芝粗多糖重復處理 6次后,蛋白脫除率僅為 41.78%,多糖回收率為 69.31%;三氯乙酸法對靈芝粗多糖中的蛋白無脫除作用;TCA-正丁醇法的多糖回收率可達 88.00%,而蛋白脫除率僅為 40.41%。活性炭和雙氧水對靈芝粗多糖均能起到較好的脫色效果,色素脫除率分別可達 87.45%和 84.37%,但多糖損失較多。徑向流色譜法蛋白脫除率和色素脫除率分別為 80.35%和88.52%,多糖回收率為 85.06%。因此,徑向流色譜法相對于傳統化學方法,不僅可以同時高效脫除靈芝粗多糖中的蛋白質和色素,而且能保持較高的多糖回收率。

表4 徑向流色譜法同各種化學方法脫蛋白脫色效果比較

2.6 徑向流色譜與軸向色譜比較

徑向流色譜柱的優勢之一就是在較高流速下反壓降較低。表 5所示為分別以 QA60、A103S為填料時不同流速下徑向流色譜柱與軸向色譜柱的壓降。試驗結果表明,以QA60為填料時,隨著流速從 5 mL/min增至 100 mL/min,軸向色譜的柱壓急劇增加;而徑向流色譜柱柱壓較低且上升較緩。以A103S為填料時,隨著流速的增加,軸向色譜柱和徑向流色譜柱的柱壓上升都比較緩慢,且兩者主要大小相差很小。分析其原因,可能是由于填料 QA60的粒徑較小 (平均粒徑為 60μm),而填料 A103S粒徑較大 (平均粒徑為 0.7 mm),填料粒徑越小床層空隙率越小,當流速增加時,柱壓上升也越快。因此,徑向流色譜柱壓較低的優勢相對于粒徑小、質地軟的填料更為顯著。

表5 徑向流色譜與軸向色譜柱壓比較

表6所示為在上樣濃度 10 mg/mL,上樣量 100 mL,上樣流速 2 mL/min,洗脫流速 40 mL/min條件下,徑向流色譜與軸向色譜對靈芝粗多糖的純化效果比較。結果表明,在相同床層體積 (250 mL)下,徑向流色譜柱以 3.15 cm的有效床層高度,取得與軸向色譜柱 46.00 cm有效床層高度基本一致的純化效果。

表6 徑向流色譜與軸向色譜純化靈芝粗多糖效果比較

3 結論

靈芝粗多糖分離純化過程中,蛋白質及色素的脫除是非常重要的一步。本文通過單因素及響應面試驗,并結合實際生產需要的基礎上,優化得出徑向流色譜脫除靈芝粗多糖中蛋白質及色素的最優工藝條件:上樣流速 2 mL/min,洗脫流速 40 mL/min,上樣量100 mL。在此條件下,蛋白脫除率為 80.35%,色素脫除率 88.52%,多糖回收率 85.06%。徑向流色譜與軸向色譜對比結果表明,徑向流色譜柱壓較低的優勢相對于粒徑小、質地相對較軟的填料更為顯著。

徑向流色譜法與各種化學方法比較結果表明:徑向流色譜脫蛋白、脫色及多糖保留效果都優于其它方法,且在處理過程中未使用有機試劑,突出了徑向流色譜法高效、經濟、安全、環保等優勢。

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Optim ization of Deprotein ization and Decoloration of Polysaccharide fromGanoderm a lucidumby Radial Flow Chromatography

Jiang Hui-yan1,Sun Pei-long2,Shao Ping2
1(Hangzhou Academy ofAgricultural Sciences,Hangzhou,310024,China)2(College ofBiological and Environmental Engineering,ZhejiangUniversity of Technology,Hangzhou 310014,China)

Radial flow chromatography(RFC)was a new technique of chromatography purification,and has a great potential in biotechnology.The deproteinization and decoloration of polysaccharide fromGanoder m a lucidiumby radial flow chromatographywere studied.The optimal conditionswere determined by single factor experiments and response surface experiments:sample concentration 10 mg/mL,sample volume 100 mL,sample flow-rate 2 mL/min and elution flow-rate 40 mL/min.The deproteinization rate,decoloration rate and polysaccharide recovery rate under the optional chromatography condition were 80.35%,88.52%and 85.06%,respectively.The purification efficiency of RFC was compared with sevagmethod,trichloroacetic acid method,activated carbon method and hydrogen perioxide method.The comparative results indicated that the purification by RFC were superior to other methods.None organic reagent in RFC treatment shows its advantages of high-efficiency,more economic,safe,and environmental friendly.

radial flow chromatography,Ganoder m a lucidiumcrude polysaccharides,deproteinization,decoloration

碩士,助理工程師 (邵平副教授為通訊作者)。

＊杭州市科技局項目 (20091932B48);國家高技術 863項目(2007AA10Z337);浙江省食用菌科技創新團隊項目(2009R50029);浙江工業大學重點基金項目(20100240)

2010-08-05,改回日期:2010-11-29