二氧化氯滅活水中隱孢子蟲的影響因素及機理研究

冉治霖,李紹峰,朱 靜,崔崇威,袁一星* (.哈爾濱工業大學市政環境工程學院,黑龍江 哈爾濱 50090；.深圳職業技術學院建筑與環境工程系,廣東 深圳 58055；.東北農業大學食品學院,黑龍江 哈爾濱 50090)

二氧化氯滅活水中隱孢子蟲的影響因素及機理研究

冉治霖1,李紹峰2,朱 靜3,崔崇威1,袁一星1*(1.哈爾濱工業大學市政環境工程學院,黑龍江 哈爾濱 150090；2.深圳職業技術學院建筑與環境工程系,廣東 深圳 518055；3.東北農業大學食品學院,黑龍江 哈爾濱 150090)

以熒光活體染色法研究了ClO2濃度、滅活時間、濁度、pH值、溫度、有機物含量等,對ClO2滅活隱孢子蟲效果的影響,并利用掃描電鏡和蛋白質實驗初步探究了滅活機理.結果顯示,當pH7.0,水溫為25℃,濁度為1NTU時,投加3mg/L ClO2經過120min,可以達到最適消毒效果(存活率小于1%),隱孢子蟲的滅活率與ClO2投加濃度、作用時間成非線性正相關.濁度是影響ClO2滅活隱孢子蟲的主要因素,濁度越低,滅活效果越佳;水溫(較)低,滅活效果稍差;酸性較于堿性更適宜ClO2滅活隱孢子蟲;可溶性有機物一定程度上影響ClO2的滅活效果.掃描電鏡和蛋白試驗表明,ClO2主要破壞其細胞表面結構,從而引起隱孢子蟲死亡.

二氧化氯；隱孢子蟲；滅活；機理

隱孢子蟲(Cryptosporidium)是一種寄生性原生動物,可引起飲用水暴發病,其主要來自于糞便污染的集中區域[1-2].隱孢子蟲在臨床上能夠引起發燒、惡心、腹痛、腹瀉等癥狀[3].免疫力正常的患者,經過適當的治療就會痊愈,但對于免疫力缺陷者會導致死亡.據美國疾病控制預防中心估計,每年約有250萬人感染隱孢子蟲病[4].而我國于1987年在南京首次發現了人隱孢子蟲病病例,之后在江蘇、重慶、安徽、內蒙、福建、山東和湖南都有相關病例報道[5].我國新出臺的《生活飲用水衛生標準》GB5749-2006[6]中明確增加了隱孢子蟲等4項微生物學指標.各國學者已開展多種消毒劑滅活隱孢子蟲效果的研究,其中包括:臭氧、氯氣、氯胺、紫外線等[7-9].近年來由于液氯用于飲用水消毒存在著諸多衛生和安全隱患,世界衛生組織和世界糧農組織已向全球推薦使用安全及高效的消毒劑—ClO2.ClO2的消毒效果遠遠優于Cl2,它在水中不水解,且在較寬pH值范圍內(2～9)消毒效果穩定[10].有研究[11]對消毒劑投量和作用時間進行了考察,但未深入系統探討水消毒過程中其他因素的影響.

本實驗使用自制高純ClO2對水中隱孢子蟲進行滅活.首先評價熒光活性染色和體外脫囊兩種方法檢測隱孢子蟲活性的可行性.在證明熒光染色可靠性的基礎上,探討投加濃度、滅活時間、溫度、pH值、濁度和有機物等因素的影響,以獲取影響ClO2滅活水中隱孢子蟲效果的條件,并初步探討ClO2滅活隱孢子蟲機理,為進一步的工程實踐提供技術支撐.

1 材料與方法

1.1 材料

ClO2,自制,純度在99.5%以上.棕色瓶低溫密封避光保存.使用時準確標定并稀釋至所需濃度.隱孢子蟲(Cryptosporidium)采于患病猴,經過篩、硫酸鋅漂浮和蔗糖梯度離心等步驟,得到濃度為3.0×106個/mL.以2.5%重鉻酸鉀懸浮保存于4℃冰箱.4,6-二脒基-2-苯基-吲哚(DAPI)、普匹碘胺(PI)、Hanks平衡鹽溶液、胃蛋白酶、牛黃膽堿鈉、胰蛋白酶等購自Sigma USA.

1.2 熒光活體染色滅活隱孢子蟲

取 0.5mL PBS(磷酸緩沖溶液)保存樣品,加入 1mL HBSS平衡鹽溶液漂洗 2次;沉淀于160μL HBSS平衡鹽溶液中,加入20μL DAPI、20μL PI儲備液,37℃溫浴 1h.溫浴后加入 1mL HBSS清洗3次,洗去未染上顏色的DAPI和PI.涂片,熒光顯微鏡下鏡檢,各樣品分別取200個卵孢囊鏡檢.

1.3 體外脫囊法滅活隱孢子蟲

消毒劑處理后的隱孢子蟲樣品懸浮于500μL純水中,加入到10mL 0.154mol/L NaCl溶液中,其中含有50mg 62U/mg 胃蛋白酶和70μL濃鹽酸,37℃溫浴 30min.迅速加入混合液(含有0.262mol/L NaHCO3、22mg/L?；悄懰徕c和4mg/L牛胰蛋白酶),37℃溫浴 120min后,樣品1000×g離心5min,取10μL脫囊后的樣品于微分干涉顯微鏡下觀察.在連續隨機視野中檢測 200個卵囊脫囊和未脫囊的個數[12].脫囊百分比的計算方法為(脫囊個數/總卵囊數)×100%

1.4 實驗方法

ClO2通入一棕色瓶,內裝有1L 0.01mol/L的磷酸鈉緩沖液,調節pH值.取若干支10mL比色管,分別加入稀釋后不同濃度的 ClO2緩沖溶液,并迅速投加 3×105個/mL隱孢子蟲懸浮液,搖床轉速為100r/min,避光反應.檢測ClO2對隱孢子蟲的滅活效果,找出最佳 ClO2投加量和作用時間.并探討在最佳滅活條件下不同濁度、溫度、pH值、有機物濃度等對滅活效果的影響.

1.5 機理研究

1.5.1 掃描電鏡觀察 樣品放入5mL的離心管中,用去離子水清洗數次,棄去上清液.加入 2.5%, pH6.8的戊二醛使淹沒樣品,并置于4℃冰箱中固定1.5h.用0.1mol/L、pH值為6.8的磷酸緩沖溶液沖洗3次,每次10min.用濃度為50%、70%、80%、90%的乙醇進行脫水,每次10～15min,再用100%的乙醇脫水3次,每次10～15min.用體積比乙醇:乙酸異戊酯為1:1的溶液,純乙酸異戊酯各置換1次,每次15min.將置換后的樣品用針頭挑出,放入濾紙疊成的小盒中,置入干燥器中干燥8h.用離子濺射鍍膜儀(IB-5(Giko)型)在樣品表面鍍上一層 1500nm厚度的金屬膜.將處理好的待檢樣品置于掃描電鏡下觀察.本試驗中掃描電子顯微鏡采用HITACHI S-4700型.

1.5.2 蛋白質實驗 反應體系中蛋白質含量利用Lowry法[13]檢測.其步驟為:標準曲線由牛血清白蛋白(Sigma, USA)標定.ClO2處理后及未經處理的2份樣品(2 × 106細胞/mL)分別5000g, 4℃,離心 5min.之后利用紫外可見分光光度計(Hitachi U-3010, Japan)檢測700nm吸光度.

2 結果與分析

2.1 熒光活體染色法和體外誘導脫囊法評價隱孢子蟲活性

在超純水中加入濃度為3×105個/mL的隱孢子蟲,分別利用活性活體染色(DAPI/PI)和誘導脫囊2種方法檢測隱孢子蟲卵囊活性(圖1).

圖1 熒光活體染色和體外誘導脫囊方法評價隱孢子蟲活性Fig.1 Evaluation of the viability of Cryptosporidium by live vital dyes and vitro excystation

由圖1可見,在滅活率方面,熒光活體染色略高于體外誘導脫囊法(平均高5.55%),但2種方法滅活規律一致,與 Joaquin等[14]研究結果相符.因此熒光活體染色法與體外誘導脫囊法均為評價隱孢子蟲卵囊活性的可靠方法[15].本研究中將采用熒光活體染色法評價ClO2滅活水中隱孢子蟲卵囊的效果.

2.2 ClO2滅活隱孢子蟲的影響因素

2.2.1 ClO2投加量的影響 超純水中, pH7.2,濁度為 1NTU(高嶺土配制的高濁度溶液稀釋并利用 HACH便攜式濁度儀測定),DOC為 1mg/L, ClO2的投加量分別為 1.0,2.0,3.0mg/L,于 25℃避光反應.反應時間分別為 1,10,30,60,120, 240min,硫代硫酸鈉終止反應后,迅速取樣.用 HBSS平衡鹽溶液12000×g離心30s 2次,洗去反應液.利用活性染色的方法染色并計數,結果見圖2.

由圖2可見,投加ClO2后,其中隱孢子蟲卵囊的滅活率與ClO2投量呈非線性正相關,在初始階段(0～10min)隱孢子蟲卵囊的活性降低較快.當ClO2的投加量為3mg/L時,經過10min反應滅活率為76.5%;1.0mg/L和2.0mg/L時滅活率分別為40.2%,70.1%.說明隨 ClO2投量的增加,隱孢子蟲卵囊的滅活率提高,所以選取 ClO2最適投量為3.0mg/L.隨著反應時間的延長,120min時反應體系中隱孢子蟲卵囊滅活率為 99.2%,240min樣品中幾乎檢測不到活性隱孢子蟲(滅活率 99.9%). ClO2滅活隱孢子蟲的機理,可能是類似于ClO2滅活細菌或者病毒,ClO2破壞了隱孢子蟲表面蛋白或內部的核酸[16],但具體機理有待進一步研究.

圖2 ClO2投加量對熒光活體染色法滅活隱孢子蟲的影響Fig.2 Viability of Cryptosporidium effected by different concentrations of ClO2

2.2.2 濁度的影響 Falabi等[17]研究表明,賈第鞭毛蟲孢囊與隱孢子蟲卵囊的去除與濁度有顯著關系.本研究在pH7、反應溫度為25℃、ClO2投量為3.0mg/L條件下,高嶺土配制原液,分別控制濁度為1,5,10NTU,考察濁度對ClO2滅活隱孢子蟲卵囊的影響,其結果見圖3.

圖3 濁度變化對熒光活體染色法滅活隱孢子蟲的影響Fig.3 Viability of Cryptosporidium effected by different turbidities

由圖3可見,ClO2滅活隱孢子蟲的效果隨著濁度的降低而加強,濁度越低,滅活效果越佳(濁度為 1NTU時的平均滅活率比 10NTU時高6.68%).可能是形成濁度的微粒為隱孢子蟲卵囊提供表面防護從而削弱滅活效果,懸浮固體提高了隱孢子蟲對消毒劑的抵抗能力.

2.2.3 水溫的影響 水溫也是影響ClO2消毒的主要因素.設置溫度5,15,25,35℃,在水樣pH=7.0,濁度為1NTU, DOC=1mg/L,ClO2投量為3.0mg/L時,對隱孢子蟲活性進行檢測,取樣時間分別為1,10,30,60,120,240min(圖4).

圖4 水溫對熒光活體染色法滅活隱孢子蟲的影響Fig.4 Viability of Cryptosporidium effected by different temperatures

由圖4可見,經過10min反應,水溫5～35℃時,隱孢子蟲卵囊的滅活率分別為 50.2%,61.5%, 70.1%和 83.5%,水溫越高,滅活效果越好.當反應時間達到60min后,從15℃到35℃的滅活效果幾乎相同(滅活率分別為:90.8 %,90.8 %和94.7 %),而 5℃時的消毒效果較差,滅活率僅為 83.1%.其原因可能是較低的溫度促使隱孢子蟲進入休眠狀態,使消毒劑不易滅活隱孢子蟲.

2.2.4 pH值的影響 在溫度25℃、濁度1NTU、隱孢子蟲初始濃度3×105個/mL、ClO2投加量為3.0mg/L時,配制不同pH值(6.5,7.5和8.5)的反應體系,連續監測隱孢子蟲卵囊存活情況,數據如見圖5.

由圖5可以看出,pH6.5時滅活效果最佳,經過 60min作用后,隱孢子蟲卵囊滅活率下降為98.0%.另外,弱堿性條件(pH8.5)隱孢子蟲卵囊滅活率為96.3%,說明弱酸性條件更適宜ClO2隱孢子蟲滅活.但是pH值(6.5～8.5)范圍內隱孢子蟲的滅活率變化不大(1%),這表明 pH值不是影響ClO2滅活隱孢子蟲的效果的主要因素.

圖5 pH值對熒光活體染色法滅活隱孢子蟲的影響Fig.5 Viability of Cryptosporidium effected by different pH value

2.2.5 有機物濃度的影響 以腐殖酸分別配制成 DOC為 1.0,2.0,5.0mg/L溶液,投加濃度3.0mg/L ClO2,濁度為1NTU,滅活3×105個/mL隱孢子蟲卵囊,熒光活性染色法測定其結果(見圖6).由圖6可見,隱孢子蟲卵子的滅活率隨ClO2作用時間的增加而增加,同時可溶性有機物的濃度和滅活率呈非線性負相關,這可能是由于可溶性有機物的存在消耗了一定量的 ClO2,從而降低了ClO2消毒效果.

圖6 有機物濃度對熒光活體染色法滅活隱孢子蟲的影響Fig.6 Viability of Cryptosporidium effected by different concentrations of DOC

2.3 ClO2滅活隱孢子蟲機理研究

消毒劑滅活微生物的機理可能是破壞細胞外殼蛋白,從而引起細胞質外泄;或引起細胞內核酸破壞,干擾核酸轉錄.為探討 ClO2滅活隱孢子蟲機理,利用Lowry試驗和掃描電鏡檢測ClO2作用隱孢子蟲前后體系中蛋白質濃度及隱孢子蟲細胞形態變化(見圖7、圖8).

從圖 7可以看出,ClO2作用隱孢子蟲初期(30min),蛋白質裂解量較少(1.11mg/L),隨著作用時間的增加蛋白質裂解量逐漸增加(從2.57mg/L 到 4.12mg/L).但當作用時間超過120min,蛋白質裂解量開始減少,出現這種情況的原因可能為 ClO2不僅有利于隱孢子蟲外殼蛋白的裂解,而且當作用時間達到一定程度,可以降解所裂解出的蛋白質.

圖7 ClO2滅活隱孢子蟲體系中蛋白質變化Fig.7 Protein mass of Cryptosporidium treated with ClO2

圖8 ClO2作用隱孢子蟲前后掃描電鏡照片Fig.8 SEM photos of Cryptosporidium treated with ClO2

從圖8可以發現,ClO2作用隱孢子蟲前(圖8a,圖 8b),細胞呈平滑的球形,且表面褶皺較少,經ClO2作用隱孢子蟲 120min后,細胞表面開始內陷,隨著作用時間的延長,細胞表面逐漸裂解,隨之細胞質開始外泄,造成隱孢子蟲死亡(圖 8c,圖8d).

3 結論

3.1 對比熒光活體染色與體外誘導脫囊2種評價隱孢子蟲卵囊活性方法,結果表明熒光活體染色法與體外誘導脫囊法同樣可靠.

3.2 當pH7.0、水溫為25℃、濁度為1NTU、投加3 mg/L時, ClO2經過120min作用,可以達到對水中隱孢子蟲的最佳消毒效果(存活率小于1%).濁度是影響 ClO2滅活隱孢子蟲效果的主要因素,濁度越低,滅活效果越佳.

3.3 在弱酸性條件下隱孢子蟲的滅活率略好于堿性條件下,反應溫度(5.0～35.0℃)范圍內,隱孢子蟲的滅活率與溫度成正相關,隨著有機物濃度的升高,滅活率降低.

3.4 掃描電鏡和蛋白試驗表明,ClO2滅活隱孢子蟲主要是破壞其細胞表面結構,引起細胞質外泄,導致隱孢子蟲死亡.

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Cryptosporidium inactivated by chlorine dioxide in water and disinfect mechanisms.

RAN Zhi-lin1, LI Shao-feng2, ZHU Jing3, CUI Chong-wei1, Yuan Yi-xing1*(1.School of Municipal and Environmental Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China；2.Department of Building and Environmental Engineering, Shenzhen Polytechnic Institute, Shenzhen 518055, China；3.Institution of Food, Northeast Agricultural University, Harbin 150080, China). China Environmental Science, 2011,31(6)：904～909

The fluorescence staining method was used to study the effect of chlorine dioxide (ClO2) inactivating Cryptosporidium in water and affecting factors (ClO2concentrations, inactivating times, pH values, temperatures, turbidities and organic contents). Then the scanning electron microscopy (SEM) and protein assay were used to investigate cell ultrastructures variation to shed light on the mechanism of inactivation preliminarily. It could achieve the optimum disinfection effect (the survival rate of less than 1%) when adding 3.0mg/L of ClO2after 120min (pH=7.0, 25℃and turbidity 1NTU), the survival rate of Cryptosporidium cysts had a non-linear positive correlation with chlorine dioxide concentration and reaction time. The turbidity on inactivation effects was also found to be statistically significant in artificial water. With increases in turbidity, the inactivating effect decreased. Inactivating rate might rise with the temperature increasing. The inactivating capability was found to be stronger under acidic than that under alkalic conditions. In some extent, concentrations of organic matter could inhibit the disinfecting effect of ClO2. Examined by scanning electron microscopy (SEM) and protein assay showed that the cell surface was damaged, some cells started the cytoplasm leakage, and then caused Cryptosporidium death.

chlorine dioxide；Cryptosporidium；inactivated；mechanisms

X505

A

1000-6923(2011)06-0904-06

2010-10-22

國家“863”項目(2006AAZ309)

* 責任作者, 教授, yyx1957@163.com

冉治霖(1980-),男,河南鄭州人,哈爾濱工業大學市政環境工程學院博士研究生,主要從事水污染控制及污水資源化技術.發表論文10篇.