三種土壤中土霉素浸提方法的比較研究

余 強,鮑艷宇,李艷梅,周啟星,2*,劉雨霞 (.南開大學環境科學與工程學院,教育部環境污染過程與基準重點實驗室,天津市城市生態環境修復與污染防治重點實驗室,天津 30007；2.中國科學院沈陽應用生態研究所,中國科學院陸地生態過程重點實驗室,遼寧 沈陽 006)

三種土壤中土霉素浸提方法的比較研究

余 強1,鮑艷宇1,李艷梅1,周啟星1,2*,劉雨霞1(1.南開大學環境科學與工程學院,教育部環境污染過程與基準重點實驗室,天津市城市生態環境修復與污染防治重點實驗室,天津 300071；2.中國科學院沈陽應用生態研究所,中國科學院陸地生態過程重點實驗室,遼寧 沈陽 110016)

以棕壤、褐土和紅壤為研究對象,比較了不同浸提方法,不同浸提劑對土壤中土霉素的浸提效率.結果表明,在所用的3種方法中,采用振蕩浸提方法,以及 Na2EDTA-McIlvaine緩沖液對土霉素具有穩定、高效的浸提回收率.土霉素形態初步分析連續浸提步驟為:以 H2O、0.1mol/L CaCl2、和Na2EDTA-McIlvaine緩沖液為浸提劑依次浸提可分別得到水溶態、可交換態、吸附態和固定態土霉素.3種土壤中土霉素形態呈現吸附態＞可交換態＞水溶態的規律.

土霉素；浸提方法；土壤；化學形態

作為廣譜類抗生素中重要的一員,土霉素被廣泛應用于畜禽養殖業中,往往會通過畜禽糞便、污水排放等方式進入到土壤環境中[1-4].在我國水產養殖場沉積物中檢出了土霉素濃度高達285mg/kg的[5],可見土霉素在土壤中的污染比較嚴重.

土壤中的有機污染物以不同的形態存在,如水溶態、結合態和固定態,其中水溶態的有效性最高,其次是吸附態,而固定態較低.由于固定態有機污染物能夠長期存在于土壤中[6],在適當的外界條件下可以被重新釋放進入土壤溶液而被生物利用,也可以直接以土壤顆粒吸附態通過擴散作用進入生物膜而被生物體利用,其生物有效性具有長效性.因此研究土壤中土霉素的不同形態對預測土霉素的潛在危害性以及對生態環境的危害程度具有預示作用.目前有關土霉素的研究主要集中在其環境行為方面[7-11],因此,開展土霉素形態分析將為深入探討其生物有效性奠定基礎.對于土壤中土霉素的浸提一直受到研究者們的關注[11-14],其關鍵在于浸提劑的選擇,本研究以棕壤、褐土和紅壤為對象,參考目前常用的浸提劑,并利用不同的浸提方法對土霉素的浸提以及形態分析進行了研究.

1 材料與方法

1.1 供試土壤

本試驗土樣有棕壤、褐土和紅壤,分別采自遼寧省沈陽市天柱山(41°49′58″ N, 123°35′8″E)、天津開發區森林公園(39°4′45″ N, 117°41′5″ E)和廣西自治區桂林市郊區(25°18′11″N, 110°21′15″ E).采用對角線布點采樣法取表層(0～20cm)土,混合均勻后采用四分法分取約 2kg土壤帶回實驗室.采樣過程均使用木質工具,樣品用塑料袋盛裝.土樣經自然風干、壓碎、除去異物后,用木棒碾碎,過 1mm(18目)尼龍篩,將過篩后樣品充分混勻,保存于聚四氟乙烯袋中備用.3種供試土壤理化性質列于表1.

表1 供試土壤基本理化性質(0～20cm)Table 1 Basic physical and chemical properties of the three tested soils(0～20cm)

1.2 藥品與試劑

土霉素標準品由中國藥品生物檢定所提供.土霉素(C22H24N2O9)為分析純(98%),購自美國sigma公司;乙腈為HPLC級試劑,購自天津康科德科技有限公司,使用前過 0.45μm有機相濾膜后超聲脫氣;試驗用水為純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司生產);草酸為優級純,其他化學試劑均為分析純.

1.3 浸提液配制

試驗用浸提液包括:水、0.01mol/L CaCl2溶液、0.1mol/L CaCl2溶液、檸檬酸緩沖液(pH=4.7±0.05)、0.1mol/L Na2EDTA-McIlvaine (pH=4.0±0.05)、0.5mol/L NaCl/0.25mol/L草酸/95%乙醇(體積比1:1:2)混合液.

檸檬酸緩沖液(pH 4.7)的配制:稱取一定量的檸檬酸鈉和檸檬酸,分別配制成0.1mol/L的溶液,按照體積比1:1混合,得到檸檬酸緩沖液.

0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine(pH 4.0±0.05)的配制: 稱取一定量的Na2HPO4、Na2EDTA和檸檬酸,分別配制成0.2, 0.4, 0.2mol/L的溶液,檸檬酸溶液與Na2HPO4溶液按照體積比8:5混合,配制成McIlvaine緩沖液.1L McIlvaine緩沖液與Na2EDTA溶液體積比1:1混合,得到0.1mol/L的Na2EDTA-McIlvaine提取液.

1.4 土壤土霉素浸提

往0.5g土壤中添加0.5mL 50mg/L土霉素水溶液,靜置24h (據預試驗結果得知,24h后3種土壤中土霉素吸附達到平衡),使土壤中土霉素污染含量為 50mg/kg.加入 25mL浸提劑按照以下方法分別進行土壤浸提:

振蕩浸提:將裝有已添加土霉素土壤的棕色小瓶放置在THZ-82A型(國華企業)恒溫振蕩機中振蕩 20min,振蕩機溫度和振蕩幅度分別為25℃和200r/min.

超聲浸提:將裝有已添加土霉素土壤的棕色小瓶放置在 KQ-250DE型(昆山舒美)超聲器中,超聲 20min,超聲溫度和功率分別為 25℃和100W.

微波浸提:將裝有已添加土霉素土壤的聚四氟乙烯微波消解罐放置在 WX-4000(上海屹堯)微波儀中35℃下持續輻射20min,微波輻射功率為100W,從室溫20℃升至35℃需要約8min.

浸提完的樣品經過 3000r/min離心 15min,取上清液,經0.45μm水系濾膜過濾.取5mL濾液通過固相萃取小柱(Waters Oasis HLB, 10ml甲醇預處理,再通 15mL的超純水),流速控制在大約3mL/min,然后用 10mL甲醇洗脫樣品,最后用氮氣濃縮盡干, 2mL甲醇定容,然后用高效液相色譜儀測定,得到土壤中不同形態的土霉素.每個樣品浸提處理重復3次,批次實驗重復3次.

1.5 測定條件

檢測儀器:Waters高效液相色譜儀(HPLC) (Waters 1525 Binary HPLC Pump,Waters 717 plus Auto sampler,Waters 2487 UV Detector),色譜柱為 Waters Xterra MS C18 (5μm×0.46mm× 250mm).進樣量為 20μL,柱溫 30℃,流速為1mL/min,流動相為乙腈/0.01mol/L草酸(體積比20:80),檢測波長 355nm,保留時間為 4.964 min,檢測限0.01mg/L,定量限0.05mg/L.

1.6 數據分析

利用SPSS 18.0進行數據統計分析,包括平均值、標準差、回歸分析以及方差分析(SNK),統計性顯著性假設為 P＜0.05.數據圖形采用origin 8.0制作.所有化學分子式均由 Chem_ Office 2006繪制.

2 結果與討論

2.1 分析方法驗證

試驗采用外標方法繪制標準曲線.稱取適量的 OTC標準品溶解在甲醇溶液當中,濃度為 1 mg/mL.配制好的儲備液-20℃陰暗處保存,2個月內使用.樣品測定前稀釋儲備液(10,20,50,200, 500,2000,5000,10000ng/mL)繪制標準曲線.向空白樣品中加標的方法來計算回收率.參考環境樣品中的濃度,回收率的濃度設置為 0.5,1.0, 5.0mg/kg.提取和分析的方法同樣品測定步驟,所有需要測定的樣品,都在儀器上重復測定3次.分別對標準溶液和加標的空白樣品重復測定(n=6)來衡量儀器的精密度和準確度.檢測限(LOD)采用信號信噪比為(S/N)=3.定量限(LOQ)采用(S/N)=10.儀器的LOD和LOQ通過直接測定標準溶液獲得,分析方法的LOD和LOQ通過空白加標的方法獲得.

2.2 土霉素不同浸提方法比較

2.2.1 振蕩浸提法 由圖1a可見,在土壤中的振蕩浸提中,各種浸提劑回收率從大到小的順序為:0.1mol/L Na2EDTA-McIlvaine緩沖液(EDTA)＞檸檬酸緩沖液(CB)＞0.1mol/L CaCl2(CaCl2_2)＞ 0.01mol/L CaCl2(CaCl2_1)＞H2O(括號中的均為浸提劑對應的簡寫標記).而0.5mol/L NaCl:0.25mol/ L草酸: 95%乙醇(體積比1:1:2)混合液(NOEL)在不同土壤中的浸提回收率大小順序不同.

圖1 不同土壤中不同浸提方法下各種浸提劑的土霉素浸提效率Fig.1 Recoveries of oxytetracycline extracted with different extractants and extraction processes in the three tested soil

SPSS 18.0的方差分析結果表明 0.1mol/L CaCl2、檸檬酸緩沖液、Na2EDTA-McIlvaine緩沖液以及0.5mol/L NaCl:0.25mol/L草酸: 95%乙醇混合液浸提效果存有顯著差異 (P＜0.05).而0.01mol/L CaCl2和H2O二者之間卻沒有顯著差異 (P＜0.05).

文獻[15-19]報道指出:土霉素上的羥基可與Ca2+、Mg2+等 2價離子進行絡合反應,也可與H2O、HCl等這樣的分子進行氫鍵作用.以0.01mol/L CaCl2水溶液為例,它可以和土霉素產生兩方面的作用:水和土霉素羥基的氫鍵作用; Ca2+與土霉素進行的絡合反應.而方差分析結果顯示,水與0.01mol/L CaCl2的浸提效果并沒有顯著性差異(P＜0.05).因此,可以推斷 0.01mol/L CaCl2水溶液浸提土壤中土霉素的機制主要是以水和土霉素氫鍵作用為主.另外,在參照 OECD Guideline 106批平衡方法[20]進行的土霉素吸附解吸實驗中,運用0.01mol/L CaCl2作為土壤pH值的緩沖液并不會對土霉素在土-水界面的環境化學行為產生額外的顯著性影響 (P＜0.05).同時,數據顯示:隨著 CaCl2水溶液中 Ca2+濃度的升高,Ca2+與土霉素進行的絡合作用逐漸成為二者之間的主要作用機制,而這種絡合作用相比氫鍵作用要強許多,這也是為什么隨著CaCl2水溶液中 Ca2+濃度的升高,浸提態土霉素回收率提高的原因.

從化學結構 (圖 2)來看,檸檬酸、檸檬酸鈉含有易與土霉素酮基、苯環和羥基作用的羥基和酮基基團.這些基團易與土霉素螯合形成大分子的螯合物,不難發現 Na2EDTA有比檸檬酸更多的易被土霉素螯合的基團.方差分析結果表明,檸檬酸緩沖液和0.1mol/L Na2EDTA-McIlvaine緩沖液浸提土壤中土霉素存在顯著差異(P＜0.05).而且浸提回收效率數據結果顯示: 0.1mol/L Na2EDTA-McIlvaine緩沖液相比于檸檬酸緩沖液浸提回收率高出10%左右.

Sassman等[11]曾嘗試利用多種由不同濃度和種類的有機助溶劑(乙醇、甲醇、乙酸乙酯、二氧雜環乙烷等)、絡合劑(甲酸、檸檬酸、草酸、EDTA以及磷酸等)和鹽類(NaCl、CaCl2、NH4Cl)組成的混合物來浸提土壤中的土霉素.其中,由0.5mol/L NaCl:0.25mol/L草酸: 95%乙醇(體積比為 1:1:2)取得了穩定而高效的土霉素浸提回收率.絡合劑與土霉素的絡合作用(提供酸性環境,利于土霉素穩定的被浸提)、助溶劑對土霉素和土壤有機質的溶解作用以及鹽類絡合陽離子作用(土壤離子交換,加快土霉素被浸提進程)共同構成了草酸混合液復雜的浸提機制.而從不同浸提方法中各浸提劑的浸提回收率數據來看,草酸乙醇混合液并沒有得到穩定的浸提回收效果.致使這種不穩定現象肯定與其復雜的浸提機制有關.這種關聯的具體細節尚待進一步的研究.

圖2 檸檬酸、檸檬酸鈉和Na2EDTA化學結構式Fig.2 Chemical structural formula of citric acid,sodium citrate and Na2EDTA

2.2.2 超聲和微波輔助浸提 如圖 1b所示,超聲浸提中不同浸提劑浸提回收率的大小順序與振蕩浸提完全相同.而在棕壤和紅壤的微波浸提中0.5mol/L NaCl:0.25mol/L草酸: 95%乙醇(體積比 1:1:2)混合液(NOEL)的浸提回收率大小順序與前2種浸提方法不同.3種浸提方法中,除了草酸乙醇混合液以外的其他浸提劑對土霉素浸提回收率大小順序相同.因此,不同方法對草酸混合液浸提回收率影響較大.這種差異的出現與草酸混合液自身的浸提機制息息相關.從圖1看來,微波輻射更有助于草酸混合液充分浸提土壤中的土霉素.

2.2.3 3種浸提方法比較 針對浸提方法進行單因素方差分析,其均值多重比較(SNK多重比較法)結果表明(圖 3),在被選用的大多數浸提劑中振蕩浸提和超聲浸提并不存在顯著差異(p＞0.05)或差異小.而微波浸提與另外兩種浸提方法均存在顯著差異(P＜0.05).

圖3 同一浸提劑不同浸提方法土霉素浸提回收率比較Fig.3 Compare of recoveries of oxytetracycline extracted by the same extractant with different extraction processes

振蕩和超聲浸提主要浸提機制在于通過不同方式使得浸提劑與土壤充分混合,將土壤中土霉素充分浸提出來.而微波的這種混合機制似乎相比前兩種要差許多.由于土壤中土霉素的浸提并不需要像提取植物、動物組織的土霉素那樣浸提首先得破壞組織結構利于土霉素的析出.因此在生物組織浸提中超聲、微波浸提優勢會愈加顯現出來,而對于土壤介質這種優勢并不明顯.微波同時也可以借助高溫達到較好的浸提效率,這一點在土壤的重金屬微波消解中有廣泛應用.由于土霉素在高溫(＞50℃)極易降解,因此也限制了微波的浸提條件.

因此,選擇以 0.1mol/L Na2EDTA-McIlvaine緩沖液為浸提劑,超聲和振蕩為浸提方法,可以達到褐土中穩定高效的土霉素浸提回收率.而對于棕壤和紅壤土中的土霉素浸提來說,大多數浸提劑的振蕩浸提效果優于超聲浸提,并且二者有顯著差異(p＜0.05);另外振蕩浸提法以其對實驗設備低要求,簡便易行更利于被實踐利用.

2.3 土壤環境中土霉素的化學形態分析

有機污染物的不同形態一定程度上指示著其在土壤環境中遷移歸趨和各種環境行為[21-22].例如,水溶態土霉素,極易隨著水流而遷移,因此也極易達到生物可觸及的范圍;可交換態土霉素,可被正離子置換下來的部分,易由根系復雜的交換機制而被生物所吸收;吸附態土霉素,則相比前兩者可被穩定的吸附于土壤顆粒、有機質等上,但是環境條件諸如pH值、Eh、水分、土壤溶液中污染物濃度、介質性質(如礦物質組成、有機質含量、CEC等)[11,23]的變化都能導致土霉素解吸作用的發生.而固定態土霉素,常常由于土壤老化、降解作用長期存留于土壤中[6],在適當的外界條件下可以被重新釋放進入土壤溶液被生物所利用.

根據2.1的結果,以H2O、0.1mol/L CaCl2和Na2EDTA-McIlvaine緩沖液為浸提劑振蕩浸提土壤中的土霉素,其浸提率之間存在顯著差異性,據此可將土壤中的土霉素分為水溶態、不同程度的結合態(即可交換態和吸附態).由于利用0.01mol/L CaCl2和H2O浸提的土霉素量差異性不大,因此選用 0.1mol/L CaCl2浸提量來表示可交換態土霉素含量.利用差減方法計算不同形態的土霉素,即水溶態、可交換態、吸附態,而添加的土霉素量減去最大提取量即為固定態的土霉素含量.

圖4 三種土壤中各浸提態土霉素分布Fig.4 Distribution of Extracted OTC fractions in the three tested soils

振蕩浸提結果表明,紅壤、棕壤和褐土的水溶態、可交換態、吸附態和固定態的土霉素所占比重分別為 0,0.13,9.24%、6.79,2.60,21.46%、51.40,35.24,49.94%和 41.81,62.03,19.36%.據此,在紅壤、棕壤和褐土中土霉素形態百分比大小分別為:吸附態＞固定態＞可交換態＞水溶態、固定態＞吸附態＞可交換態＞水溶態和吸附態＞可交換態＞固定態 ＞水溶態.從 3種典型土壤中形態分布數據可以看出吸附態＞可交換態＞水溶態在三種土壤中均成立.而不同土壤中固定態土霉素含量比差異很大.這應該是與土壤物理化學性質息息相關.吸附態是土壤環境中土霉素的主要存在形態.由于有機污染物的形態直接影響著其生物有效性,因此,高含量的吸附態土霉素成為了影響褐土環境中土霉素生物有效性的重要因素.Young等[24]提出的有機污染物在土壤中吸附分布活性模型中認為,土壤中的吸附活性點位分布在3個域:具有表明活性的礦物質、松散的非剛性有機質和致密的剛性有機質.其中,土壤礦物質域發生的表面吸附是典型的線性可逆過程,瞬間達到平衡;隨后有機污染物在土壤的非剛性有機質中發生分配;達到分配擴散后,再向剛性有機質緩慢擴散,分配在其中的有機物則不易脫附.根據這個理論,高含量的吸附態土霉素會隨著時間的遷移,逐漸向剛性有機質緩慢擴散,不利于被迅速脫附下來.這是一個慢吸附和慢脫附過程甚至是一個不可逆的吸附過程.因此,高含量的吸附態土霉素有向固定態轉化從而長期存留于土壤的巨大生態風險.

3 結論

3.1 三種浸提方法中,以振蕩和超聲浸提對土壤中土霉素具有很好且穩定的浸提效果,而微波浸提效果較差.各種浸提劑中(檸檬酸緩沖液,Na2EDTA-McIlvaine緩沖液, NaCl、草酸和乙醇混合液),以Na2EDTA-McIlvaine緩沖液對土壤中土霉素的浸提率最高和最穩定.

3.2 不同浸提劑(H2O、0.1M CaCl2、和Na2EDTA-McIlvaine緩沖液)對土壤中土霉素浸提回收率存在很大的差異性,這與它們的提機制不同有關.據此,三種土壤中土霉素形態占總量比例大小順序:吸附態＞可交換態＞水溶態.不同土壤中固定態土霉素含量比差異很大.

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Compare of different oxytetracycline extraction methods in the three soils.

YU Qiang1, BAO Yan-yu1, LI Yan-mei1, ZHOU Qi-xing1,2*, LIU Yu-xia1(1.Key Laboratory of Pollution Processes and Environmental Criteria, Ministry of Education, Tianjin Key Laboratory of Environmental Remediation and Pollution Control, College of Environmental Science and Engineering, Nankai University, Tianjin 300071,China；2.Key Laboratory of Terrestrial Ecological Process, Institute of Applied Ecology, Chinese Academy of Sciences, Shenyang 110016,China). China Environmental Science, 2011,31(6)：951～957

Recoveries of oxytetracycline extracted were discussed with different extractants and extraction processes in the brown, cinnamon, and red soil. Stable and efficient extracted recovery could be achieved by using Na2EDTA-McIlvaine as a extractant in the shake flask extraction. In addition, a sequential extraction procedure was developed to study the chemical speciation of oxytetracycline in the soils. The soils were extracted by H2O, 0.1mol/L CaCl2, and Na2EDTA-McIlvaine in order. As a result, water-soluble, exchangeable, and adsorbed fractions were obtained. Moreover, it could conclude that the orders of amount of those fractions are as follows: adsorbed＞ exchangeable ＞water-soluble fractions in the three tested soils.

oxytetracycline；extraction method；soil；chemical speciation

X53

A

1000-6923(2011)06-0951-07

2010-10-03

國家自然科學基金資助項目(40901259)

* 責任作者, 教授, zhouqx523@yahoo.com

余 強(1987-),男,江西九江人,南開大學環境科學與工程學院碩士研究生,主要研究方向為有機污染物化學形態分析.發表論文4篇.