連續流發酵條件下不同發酵類型產氫細菌的產氫特性分析

張露思，任南琪，高 磊，鄭國香，3

（1.哈爾濱工業大學城市水資源與水環境國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150090；

2.哈爾濱工業大學建筑設計研究院，黑龍江 哈爾濱 150090；

3.東北農業大學農業工程中心，黑龍江 哈爾濱 150030）

連續流發酵條件下不同發酵類型產氫細菌的產氫特性分析

張露思1，2，任南琪1，高 磊1，鄭國香1，3

（1.哈爾濱工業大學城市水資源與水環境國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150090；

2.哈爾濱工業大學建筑設計研究院，黑龍江 哈爾濱 150090；

3.東北農業大學農業工程中心，黑龍江 哈爾濱 150030）

運用連續流實驗裝置，考察了E.harbinenseYUAN-3，C.butyricum1.209和E.cloacae1.2022在其各自的優化培養基條件下產氫能力.對反應體系pH值、累積產氣及產氫量、產氫速率、比產氫速率及液相末端產物進行了對比分析.結果表明：C.butyricum1.209的繁殖速度很快，pH值在3.6～4.3之間，有利于乙醇發酵和丁酸發酵產氫細菌的釋氫；發酵80h的時間里，E.harbinenseYUAN-3在最短的時間內開始產氣，并且在較短時間內上升，隨后保持穩定；從單位體積產氫量上來看，C.butyricum1.209相對于E.harbinenseYUAN-3和E.cloacae1.2022都顯示較強的優勢.

生物制氫；乙醇發酵；丁酸發酵；混合酸發酵

有機廢水厭氧發酵法生物制氫是利用兩相厭氧生物處理工藝中的產酸相作為制氫單元，從有機廢水中制取氫氣，達到集生物制氫和有機廢水處理為一體的雙重功效.有機廢水的產酸發酵主要存在4種發酵類型：乙醇發酵，丙酸發酵、丁酸發酵和混合酸發酵［1－5］.普遍認為，廢水厭氧生物處理過程中出現的主要問題之一是啟動過程常難于控制［6］，發酵法生物制氫反應器作為兩相厭氧系統的產酸相，同樣面臨著啟動過程慢，目標發酵產物具有一定的不確定性等問題，因此啟動過程完成后有可能形成上述3種發酵類型中的任何一種.而不同的發酵類型其產氫能力存在較大差異，即發酵類型將直接影響系統的產氫能力.

連續流生物制氫反應器的產氫效能，在很大程度上取決于反應器所形成的發酵類型，而反應器形式的發酵類型與反應器啟動時對生態因子的調控有很大的關系［7－8］.對于生物制氫反應器來說，啟動時反應器運行的第一步是關鍵的一步，不同的啟動方式可以決定不同微生物菌群的結構和功能，進而演替成不同的頂級群落并形成不同的發酵類型，影響反應器運行的效果.目前，在啟動生物制氫反應器的過程中，宮曼麗博士通過生態因子的調控［9］，確定了啟動時的各項生態因子參數，以此作為依據，可以做到反應器定向啟動，實現乙醇發酵、丁酸發酵、混合酸發酵等，但依然面臨啟動周期長、產氫能力提高緩慢等問題，因此快速高效的啟動生物制氫反應器對于工程應用具有重要意義.

本文以E.HarbineseYUAN-3，C.butyricum1.209和E.cloacae1.2022為代表菌株，在其各自的優化培養基條件下，運用連續流實驗裝置，分別對乙醇發酵、丁酸發酵和混合酸發酵產氫細菌的產氫能力進行對比分析，以便更全面的了解這3種代謝類型發酵、生長及其他優良性能.

利用葡萄糖（20g／L）作為底物，厭氧發酵裝置內裝入2.5L的發酵液及適量污泥，按反應溶液體積的10%分別接種三株產氫細菌，在非滅菌條件下進行氫氣生產的連續培養實驗.發酵液中添加適量的微量元素和維生素等物質，發酵時間為80h，溫度為（35±1）℃，培養液流速是625mL／h，利用pH＝6的磷酸鹽緩沖溶液調節發酵液的pH值，使進水pH值控制在6.0～6.5.

1 實驗菌種及接種污泥

1.1 實驗菌種

乙醇發酵產氫細菌為哈爾濱產乙醇桿菌E.HarbineseYUAN-3，來源于哈爾濱工業大學環境生物技術研究中心；丁酸發酵產氫細菌為丁酸梭菌C.butyricum1.209，來源于中科院菌種保藏中心；甲酸型產氫細菌為陰溝腸桿菌E.cloacae1.2022，來源于中科院菌種保藏中心.

1.2 接種污泥

接種污泥來自哈爾濱文昌污水處理廠二沉池，先用糖蜜廢水及少量的N和P曝氣培養，使生物量增加.當污泥接種量為6.5g／L時，投加到發酵罐中進行連續流產氫試驗.

2 實驗裝置與實驗方法

2.1 實驗裝置

連續流實驗裝置采用離位滅菌玻璃發酵罐進行批次培養試驗.

2.2 實驗方法

葡萄糖濃度測定采用葡萄糖氧化法試劑盒（GOD-PAP）；pH值測定采用pH計測定（Cyberscan，Model 510）；氫氣含量測定采用上海分析儀器廠生產的SC－Ⅱ型氣相色譜儀，熱導池檢測器，不銹鋼柱，柱長與直徑尺寸為2m×5mm，載體為 TDS-01（3.33×105～3.33×105nm），載氣為 N2，流速為70mL／min，室溫測定，進樣量為500μL.

液相末端產物測定采用上海分析儀器廠生產的GC122型氣相色譜儀，不銹鋼柱，柱長為2m（內徑為5mm），載體為GDX103（3.33×105～3.33×105nm），氫火焰監測器，汽化室為200℃，柱溫為190℃，檢測室溫度為240℃，載氣為N2，N2流速為50mL／min，氫氣流速為50mL／min，空氣流速為500mL／min.取1mL培養液，加入6mol／L HCl 1～2滴，在5 000rpm下離心15min，取上清液2μL進樣檢測.

3 結果與討論

3.1 發酵過程中pH的對比

發酵液的pH變動情況是衡量反應系統產氫狀態的一個很關鍵的指標，它的波動將直接反映出產氫體系的運行狀況.圖1為發酵液的pH曲線波動圖，E.HarbineseYUAN-3，C.butyricum1.209 和E.cloacae1.2022在發酵啟動和運行初期的24h內，發酵液的pH變動均較大，分別從最初的6.1，5.5和5.9降到了4.2，4.2和3.4.

由于輸入的新鮮培養液里有磷酸鹽緩沖液的調節，使E.HarbineseYUAN-3和C.butyricum1.209反應體系的pH控制在3.6～4.3之間，這一pH范圍有利于乙醇發酵和丁酸發酵產氫細菌的釋氫.而對照E.cloacae1.2022的pH曲線變化趨勢顯示，在發酵24h內pH下降到3.5，波動范圍也較大，在2.9～3.9之間波動.

圖1 連續流培養條件下不同發酵類型產氫菌pH變化曲線

3.2 單位體積產氣量和產氫量的對比

獲得發酵產氫性能優良及具有高效、穩定生產氫氣的產氫菌是比較3種代謝途徑的主要目的，而鑒定哪一種代謝類型的產氫細菌具有高產氫能力的最直接指標是參考其氫氣的產量.圖2給出乙醇發酵產氫細菌E.HarbineseYUAN-3、丁酸發酵產氫細菌C.butyricum1.209和混合酸發酵產氫細菌E.cloacae1.2022連續培養條件下的單位體積產氣量的變化曲線圖，從接入產氫細菌后的10h左右，產氫細菌需要利用現有的發酵營養物質進行大量的繁殖，為產氫做好充分的準備，因此，這段時間幾乎未監測到有氣體生成.隨著菌體繁殖的繼續進行，開始逐漸監測到氫氣（見圖3），但氣體總量還很小，隨后逐漸加大.

圖2 連續流培養條件下不同發酵類型產氫菌單位體積產氣量變化曲線

圖3 連續流培養條件下不同發酵類型產氫菌單位體積產氫量變化曲線

當發酵培養24h時開始進行培養液的輸入和發酵液的排出，從而開始連續流培養階段.由于菌體不斷獲得新鮮營養液，代謝逐漸旺盛，累積產氣和產氫呈現持續遞增趨勢.在發酵進行到第28小時開始，E.HarbineseYUAN-3，C.butyricum1.209和E.cloacae1.2022開始產氫，并且C.butyricum1.209的釋氫能力更強一些，迅速上升到2.46mmol／L時，開始趨于穩定.當發酵結束時，E.HarbineseYUAN-3的單位體積產氣量和產氫量分別達到2.67和1.57mmol／L；C.butyricum1.209的發酵產氣曲線顯示，產氣的初始時間為28h，延后于E.HarbineseYUAN-3，進入連續培養后，產氣逐漸加大，發酵80h時，單位體積產氣量和產氫量分別為2.57和1.90mmol／L；E.cloacae1.2022的發酵曲線顯示，產氣初始時間也是28h，跟C.butyricum1.209產氣時間一樣，但其產氣量卻遠遠小于C.butyricum1.209，上升速度也較C.butyricum1.209緩慢，當反應結束時，單位體積產氣量和產氫量分別達到2.04和0.82mmol／L.發酵80h的時間里，E.HarbineseYUAN-3在最短的時間內開始產氣，并且在較短時間內上升并且保持穩定，但從產氫量上來看，C.butyricum1.209的產氫量較E.HarbineseYUAN-3高.

3.3 單位體積產氫速率和比產氫速率的對比

單位體積產氫速率和比產氫速率是衡量反應體系的產氫性能的關鍵指標，其中，比產氫速率也叫氫氣生產速率，是表明菌種轉換底物為氫的能力大小的重要參數.圖4和5顯示了連續培養狀態下，E.HarbineseYUAN-3，C.butyricum1.209和E.cloacae1.2022單位體積產氫速率和比產氫速率的變動曲線.

結果表明，在運行初始的0～24h階段，三株產氫菌的比產氫速率較低，處于0～0.59（n（H2）／n（葡萄糖））.隨著培養時間的增加，單位體積產氫速率和比產氫速率顯示快速增長的趨勢，培養24～34h階段，其單位體積產氫速率和比產氫速率都迅速上升，此時E.HarbineseYUAN-3，C.butyricum1.209和E.cloacae1.2022的單位體積產氫速率分別達到了48.09，39.75和26.07mmol／L·h；比產氫速率分別達到了5.5，5.29和2.48（n（H2）／n（葡萄糖））.進入連續培養階段后，新鮮營養液的輸入引起C.butyricum1.209的單位體積產氫速率產生波動，趨于快速上升的勢頭.發酵40h時，單位體積產氫速率和比產氫速率分別獲得最大值，即87.60和5.90（n（H2）／n（葡萄糖））.隨著反應體系的繼續，單位體積產氫速率呈現逐漸下降的趨勢，但比產氫速率變化不大，即C.butyricum1.209的比產氫速率在連續培養階段波動范圍在5.0～5.9（n（H2）／n（葡萄糖））之間.

E.HarbineseYUAN-3連續培養過程中，單位體積產氫速率和比產氫速率的變化曲線結果顯示，最初的24h發酵時間里，E.HarbineseYUAN-3產生很少的氣體，隨著培養時間的繼續進行，菌體代謝逐漸加強，產氣增加，單位體積產氫速率和比產氫速率也逐漸增加，培養32h時，E.HarbineseYUAN-3的單位體積產氫速率和比產氫速率分別為24.03和2.14（n（H2）／n（葡萄糖）），基礎階段的產氫及產氫速率稍低于C.butyricum1.209.進入連續培養后，E.HarbineseYUAN-3的單位體積產氫速率和比產氫速率都出現一定程度的波動，發酵時間為44h時獲得最大比產氫速率和單位體積產氫速率，分別為5.29（n（H2）／n（葡萄糖））和72.42mmol／L·h.隨著發酵體系的逐漸穩定，單位體積產氫速率逐漸降低，比產氫速率在4.17～4.95（n（H2）／n（葡萄糖））范圍內波動.E.cloacae1.2022在連續培養過程中，最初的30h發酵時間里，E.cloacae1.2022幾乎沒有H2產生，隨著培養時間的繼續進行，菌體代謝逐漸加強，產氣逐漸增加，單位體積產氫速率和比產氫速率也逐漸增加，培養34h時，E.cloacae1.2022的單位體積產氫速率和比產氫速率分別為20.67和1.34（n（H2）／n（葡萄糖）），基礎階段的產氫及產氫速率明顯低于E.HarbineseYUAN-3和C.butyricum1.209.進入連續培養后，E.cloacae1.2022的單位體積產氫速率和比產氫速率都出現一定程度的波動，發酵時間為50h時獲得最大比產氫速率和單位體積產氫速率，分別為2.63（n（H2）／n（葡萄糖））和37.66mmol／L·h.隨著發酵體系的逐漸穩定，單位體積產氫速率逐漸降低，比產氫速率在2.34～2.63（n（H2）／n（葡萄糖））范圍內波動.

圖4 連續流培養條件下不同發酵類型產氫菌單位體積產氫速率變化曲線

圖5 連續流培養條件下不同發酵類型產氫菌比產氫速率變化曲線

3.4 液相末端產物的變化

3種產氫細菌的代謝類型差異直接影響到其發酵性能，圖6—8顯示的是乙醇發酵產氫細菌E.HarbineseYUAN-3、丁酸型發酵產氫細菌C.butyricum1.209和混合酸發酵產氫細菌E.cloacae1.2022連續培養液相末端產物的變化曲線圖，在前期的0～24h內，三株菌的揮發酸總量變化都不大，在一定范圍內波動，發酵24h時三者的揮發酸總量迅速上升，分別達到1 155，1 147和1 852mg／L.進入連續培養階段，揮發酸總量繼續增加，在24～40h，C.butyricum1.209的揮發酸總量增加幅度較大（見圖7），C.butyricum1.209平均增加速度為74mg／L·h，高于E.HarbineseYUAN-3的平均增長速度（62mg／L·h）和E.cloacae1.2022的平均增長速度（61mg／L·h）.40h以后反應體系的揮發酸總量在1 466～2 510mg／L之間波動，揮發酸總量最大值（2 510mg／L）.相比之下，E.HarbineseYUAN-3的揮發酸在發酵時間為40h時獲得最大值（2 157mg／L），E.cloacae1.2022的揮發酸在發酵時間為42h時獲得最大值（2 947mg／L）.

圖6 連續流培養條件下乙醇發酵產氫細菌E.Harbinese YUAN-3液相末端產物變化曲線

7 連續流培養條件下丁酸發酵產氫細菌C.butyricum1.209液相末端產物變化曲線

液相末端產物總量的大小反映產氫運行體系的菌群代謝狀況，而它的具體組成種類和比例將反映出產氫運行體系的代謝類型.根據圖6分析，發現乙醇和乙酸仍然是E.HarbineseYUAN-3的主要液相末端產物，在反應運行前期，即0～10h階段，乙醇和乙酸的濃度逐漸增加，乙酸的濃度略比乙醇高，但隨著菌體代謝的逐漸增強，葡萄糖利用率加快，生物量也逐漸增加，乙醇的濃度逐漸大于乙酸.發酵24h時，乙醇和乙酸的摩爾濃度比值達到1.68.當進入連續培養階段后，乙醇和乙酸的質量濃度分別在752～1 531mg／L和496～815mg／L之間變動，乙醇和乙酸的摩爾濃度比值維持在1.47～3.22之間.C.butyricum1.209的液相末端產物的組成除乙醇和乙酸外，還監測到少量濃度的丙酸和大量的丁酸（見圖7）.發現丁酸和乙酸是C.butyricum1.209的主要液相末端產物，在反應運行前期，即0～10h階段，丁酸和乙酸的濃度逐漸增加，乙酸的濃度略比丁酸高，但隨著菌體代謝的逐漸增強，葡萄糖利用率加快，生物量也逐漸增加，丁酸的濃度逐漸大于乙酸.發酵30h時，丁酸和乙酸的摩爾濃度比值達到2.62.當進入連續培養階段后，丁酸和乙酸的質量濃度分別在735～1 531mg／L和403～853mg／L之間變動，丁酸和乙酸的摩爾濃度比值維持在1.37～2.44之間.E.cloacae1.2022的液相末端產物主要以乙酸和甲酸為主，并有少量的乙醇、丙酸和丁酸.在反應運行前30h階段，甲酸的濃度逐漸增加，此時乙酸和丙酸的濃度略比甲酸高，但隨著菌體代謝的逐漸增強，葡萄糖利用加快，生物量也逐漸增加，甲酸的濃度逐漸大于乙酸，丙酸含量逐漸下降.發酵30h時，甲酸和乙酸的摩爾濃度比值達到1.14.當進入連續培養階段后，甲酸和乙酸的質量濃度分別在735～1 421mg／L和474～802mg／L之間變動，甲酸和乙酸的摩爾濃度比值維持在1.33～3.23之間.

圖8 連續流培養條件下混合酸發酵產氫細菌E.cloacae 1.2022液相末端產物變化曲

4 小結

本章主要考察了乙醇發酵產氫細菌E.HarbineseYUAN-3、丁酸發酵產氫細菌C.butyricum1.209和混合酸發酵產氫細菌E.cloacae1.2022在其各自的優化培養基條件下，運用連續流實驗裝置，分別對乙醇發酵、丁酸發酵和混合酸發酵產氫細菌的產氫能力進行對比分析并得到如下結論：

（1）E.HarbineseYUAN-3，C.butyricum1.209和E.cloacae1.2022在發酵啟動和運行初期的24h內，發酵液的pH 變動均較大，分別從最初的6.10，5.46和5.90降到了4.16，4.23和3.37，pH 在3.6～4.3范圍內有利于乙醇發酵和丁酸發酵產氫細菌的釋氫.

（2）發酵80h的時間里，E.HarbineseYUAN-3的在最短的時間內開始產氣，并且在較短時間內上升并且保持穩定.在運行初始的0～24h階段，三株產氫菌的比產氫速率較低，處于0～0.59（n（H2）／n（葡萄糖））范圍內.隨著培養時間的增加，單位體積產氫速率和比產氫速率顯示快速增長的趨勢，培養24～34h階段，其單位體積產氫速率和比產氫速率都迅速上升.E.cloacae1.2022基礎階段的產氫及產氫速率明顯低于E.HarbineseYUAN-3和C.butyricum1.209.

（3）3種產氫細菌在前期的0～24h內的揮發酸總量變化都不大，發酵24h時三者的揮發酸總量迅速上升，在24～40h這一階段，C.butyricum1.209的揮發酸總量增加幅度較大，40h以后反應體系的揮發酸總量在1 466.11～2 510.68mg／L之間波動，揮發酸總量最大值為2 510.68mg／L.相比之下，E.HarbineseYUAN-3的揮發酸在發酵時間為40h時獲得最大值為2 157.64mg／L，E.cloacae1.2022的揮發酸在發酵時間為42h時獲得最大值為2 947.93mg／L.

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［9］ 宮曼麗.連續流生物制氫反應器的定向啟動及群落演替規律［D］.哈爾濱：哈爾濱工業大學，2006：108-120.

Effects of factors on fermentative hydrogen producing bacteria of different types by continuous flow test

ZHANG Lu-si1，2，REN Nan-qi1，GAO Lei1，ZHENG Guo-xiang1，3
（1.State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China；
2.The Architectural Design and Research Institute，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China；
3.The Centre of Agricultural Engineering，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Continuous flow test device was adopted so that analyses and comparisons were made on the hydrogen-generating capacity ofE.harbinenseYUAN-3，C.butyricum1.209andE.cloacae1.2022 under their respective optical culture conditions.The following conclusion was arrived at through analyses and comparisons on biomass of cells，pH value of reaction system，accumulated volume of gases and hydrogen generated，hydrogen-generating speed，specific hydrogen-generating speed，and products at the end of liquid phase：C.butyricum1.209multiplied rapidly；pH value within 3.6～4.3 was beneficial for the hydrogen-release of alcoholic fermentative bacteria and butyric acid fermentative bacteria；E.harbinenseYUAN-3began to generate gases within the shortest time in the first 80hof fermentation，and the yield of gases rose within a short time and then it kept stable；however，C.butyricum1.209was superior toE.harbinenseYUAN-3andE.cloacae1.2022in hydrogen yield per unit volume，utilization rate of glucose and hydrogen content.

biohydrogen production；ethanol-type fermentation；butyric acid fermentative；mixed acid fermentative

X 322

610·10

A

1000-1832（2011）03-0106-06

2011-05-26

城市水循環過程中污染物轉化規律與安全保障基礎研究項目（50638020）；中國博士后科學基金資助項目（AUGA41309045）；黑龍江省博士后基金資助項目（AUGA41100165）.

張露思（1981—），女，博士研究生，講師，主要從事生物制氫研究；通信作者：鄭國香（1972—），女，副研究員，主要從事生物能源利用與轉化研究.

石紹慶）