三聚氰胺在不同流動相體系中的紫外吸收光譜

曹小彥 彭新凱 汪 輝 胡朝暉 黎 瑛 夏延斌

（1.長沙市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測中心，湖南 長沙 410013；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

三聚氰胺在不同流動相體系中的紫外吸收光譜

曹小彥1，2彭新凱1汪 輝1胡朝暉1黎 瑛1夏延斌2

（1.長沙市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測中心，湖南 長沙 410013；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

研究三聚氰胺在不同流動相中的紫外吸收情況。結(jié)果表明：三聚氰胺在不同溶劑中的紫外吸收不同，使用不同流動相測定三聚氰胺時，應(yīng)選取相對應(yīng)的檢測波長。在沒有檸檬酸體系的流動相中應(yīng)采用203nm左右或236nm左右的檢測波長；而在有檸檬酸體系的流動相中應(yīng)采用236nm左右的檢測波長。

三聚氰胺；流動相；紫外吸收光譜；色譜

2007年美國發(fā)生的許多貓狗寵物非正常死亡事件（美國FDA經(jīng)過調(diào)查確認是寵物食品的原料受非法添加的三聚氰胺污染，原料來自中國）和2008年“三鹿奶粉”事件引起了極大的社會反響。三聚氰胺即蜜胺（結(jié)構(gòu)式見圖1），又稱氰尿酰胺，白色晶體，相對密度1.573（250℃），熔點354℃，難溶于水、乙二醇、甘油和吡啶，略溶于乙醇，不溶于乙醚、苯和四氯化碳［1］。它是一種非食品添加劑，之所以被加入至食品中是因為三聚氰胺含氮量高達66.7%，可以增加食品的含氮量，冒充高蛋白食品，從而大幅度降低成本。而目前常用來檢測蛋白質(zhì)的“凱氏定氮法”，檢測飼料和食品中的粗蛋白質(zhì)的含量，其實只是檢測氮的含量，再根據(jù)蛋白質(zhì)的含氮量（15%～17%）折算成蛋白質(zhì)的含量，因此無法區(qū)分真假蛋白質(zhì)。

圖1 三聚氰胺結(jié)構(gòu)式Figure 1 The configuration of melamine

目前國內(nèi)外測定食品中三聚氰胺含量的方法一般采用液相色 譜 法［2－4］、液 相 － 質(zhì) 譜 法［5，6］、氣 相 － 質(zhì) 譜 法［7］等。HPLC－UV色譜法是研究和鑒定三聚氰胺的最有效的方法之一。對不同流動相體系的紫外吸收光譜的研究是HPLC－UV色譜法的理論基礎(chǔ)，通過研究不同流動相體系的紫外吸收光譜，為找出相對應(yīng)的檢測波長，提高靈敏度，降低檢出限提供理論指導(dǎo)。但國內(nèi)外關(guān)于三聚氰胺在不同流動相體系中的紫外吸收光譜的研究還未見報道。溶劑是影響三聚氰胺紫外吸收光譜的重要因素，本試驗通過對三聚氰胺在不同流動相中的紫外吸收的研究，找出在有無檸檬酸體系的流動相中的最佳檢測波長。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

高效液相色譜儀（配VWD檢測器）：Agilent 1200，美國安捷倫科技有限公司；

雙光束紫外可見分光光度儀：TU－1900，北京普析通用儀器有限公司。

1.2 主要試劑

三聚氰胺標準品：＞99.5%，國家標準物質(zhì)中心；

庚烷磺酸鈉，乙腈，甲醇，辛烷磺酸鈉：均為色譜純；

檸檬酸，硫酸銨，磷酸二氫鉀：均為分析純。

1.3 試驗方法

根據(jù)中國國家標準（GB／T 22388——2008）［2］及參考文獻［8］中高效液相色譜法測定三聚氰胺含量所采用的不同流動相和三聚氰胺在不同溶劑中的溶解情況，精確稱取一定量的三聚氰胺標準品，分別用流動相定容（見表1），配置成濃度為5μg／mL的三聚氰胺溶液，在TU－1900雙光束紫外可見分光光度儀中進行分析，依次對各樣品在190～400nm波長范圍內(nèi)進行紫外波長掃描，狹縫寬度為0.5nm，石英比色皿厚度為1cm，用相對應(yīng)的空白溶劑作參比。

表1 流動相與對應(yīng)的檢測波長Table 1 Mobile phase and corresponding determination wavelengh

HPLC的操作方法均采用相對應(yīng)中國國家標準［2］及參考文獻［3－8］所述方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 三聚氰胺在不同溶劑中的紫外吸收

配置三聚氰胺標準溶液常用的溶劑是甲醇、乙腈、水、甲醇－水、乙腈－水。試驗考查了相同濃度的三聚氰胺在水、甲醇－水（70＋30）、乙腈－水（70＋30）、乙腈和甲醇5種溶劑中的紫外光譜（見圖2）。

圖2 三聚氰胺標準溶液的紫外吸收光譜Figure 2 Ultraviolet absorption spectral of melamine standard solution

由圖2可知，在所考查的5種不同極性溶劑中，三聚氰胺的紫外吸收光譜形狀基本一致，吸收峰最大移動僅2nm，說明這5種溶劑對三聚氰胺的紫外吸收的影響較小。但在以水作為溶劑的三聚氰胺譜圖中，在203nm與235nm處最大吸收峰強度相對另外4種溶劑較大。因此建議配制三聚氰胺標準使用溶液時以水作溶劑較為合適。

2.2 三聚氰胺在不同流動相中的紫外吸收

三聚氰胺在不同流動相的紫外可見光譜（見圖3，流動相同表1）。最大吸收光譜波長主要與分子中共軛雙鍵的長度及生（助）色基團有關(guān)。從圖3可以看出，用不同流動相溶解三聚氰胺時，三聚氰胺紫外吸收波長有一定的相似性，在236.0nm附近都有吸收。這是因為三聚氰胺－C═N－雙鍵組成的六元環(huán)共軛結(jié)構(gòu)，n→π＊躍遷和六元環(huán)的振動的重疊引起的，使得其吸收帶紅移［9－11］。

圖3 不同流動相對三聚氰胺紫外吸收光譜的影響Figure 3 The infection of ultraviolet absorption spectral of melamine by different mobile phase

由于三聚氰胺目前的檢測方法多為液相色譜法，因此需要考查不同色譜流動相中三聚氰胺的紫外吸收光譜，為選擇合適的色譜條件提供指導(dǎo)。

2.2.1 不同流動相體系對三聚氰胺紫外吸收的影響 三聚氰胺在不同流動相中的紫外吸收波長不完全相同。這主要分兩個體系：① 有檸檬酸的流動相體系；② 無檸檬酸的流動相體系。無檸檬酸的流動相體系基本遵循三聚氰胺各官能團的紫外吸收原則，最大吸收波長在205nm附近。有檸檬酸的流動相體系由于檸檬酸本身的紫外吸收（見圖4），使三聚氰胺的低波長吸收峰紅移［11］。

圖4 檸檬酸和離子對試劑的紫外吸收光譜Figure 4 The infection of ultraviolet absorption spectral of citric acid and different ion reagent

2.2.2 離子對試劑對三聚氰胺紫外吸收的影響 在有檸檬酸體系的流動相中，對不同離子對試劑（相同濃度己烷磺酸鈉、庚烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉）對三聚氰胺紫外吸收光譜影響作了研究，發(fā)現(xiàn)離子對試劑對三聚氰胺紫外吸收影響甚微（見圖5）；同時分別在有檸檬酸的流動相體系中改變庚（辛、己）烷磺酸鈉濃度為0.010，0.005，0.001mol／L（見圖6），發(fā)現(xiàn)其濃度變化對三聚氰胺紫外吸收影響小，僅低波長吸收峰隨著離子對濃度的增加發(fā)生微小的增色效應(yīng)。

圖5 離子對試劑對三聚氰胺的紫外吸收光譜影響Figure 5 The infection of ultraviolet absorption spectral of melamine by different ion reagent

2.2.3 檸檬酸對三聚氰胺紫外吸收的影響 在有檸檬酸體系的流動相中，三聚氰胺的紫外吸收光譜又隨檸檬酸濃度發(fā)生變化。本試驗分別在檸檬酸體系的流動相體系中改變檸檬酸濃度為0.010，0.005，0.001mol／L（見圖7）。隨著檸檬酸濃度增大，三聚氰胺低波長吸收峰紅移程度越大，相對高吸收波長卻無明顯變化。

另外，還參照文獻［11］所提供的色譜條件，有針對性的選取了幾個波長，用高效液相色譜法作了比較。當(dāng)檢測波長為203，205，210nm時，有檸檬酸的流動相體系則由于基線干擾非常大，靈敏度低，檢測限值高（見圖8）；而無檸檬酸的流動相體系則基線平穩(wěn)，靈敏度高，檢測限值低，能達到0.01mg／kg（見圖9）；當(dāng)檢測波長為215nm時，各流動相響應(yīng)相當(dāng)；當(dāng)檢測波長為236nm和240nm時，各流動相幾乎都有相應(yīng)的響應(yīng)值，但檢測限值最低為2mg／kg。選擇適合自己的流動相體系，除檢測限外，還應(yīng)從成本、做樣過程中受干擾程度和流動相對儀器影響程度等因素綜合考慮。因此，應(yīng)根據(jù)實際情況來選擇合適的色譜條件。

圖6 離子對試劑濃度對三聚氰胺的紫外吸收光譜影響Figure 6 The infection of ultraviolet absorption spectral of melamine by the concentration of ion reagent

圖7 檸檬酸濃度對三聚氰胺的紫外吸收光譜影響Figure 7 The infection of ultraviolet absorption spectral of melamine by the concentration of citric acid

圖8 三聚氰胺色譜圖（有檸檬酸的流動相體系，203nm，2mg／L）Figure 8 The chromatogram of melamine（in citric acid mobile phase system，203nm，2mg／L）

圖9 三聚氰胺色譜圖（無檸檬酸的流動相體系，203nm，2mg／L）Figure 9 The chromatogram of melamine（in non－citric acid mobile phase system，203nm，2mg／L）

3 討論

從試驗的結(jié)果可以看出，三聚氰胺在不同流動相中紫外吸收波長是不同的。可見，根據(jù)溶解三聚氰胺標準品的某一種溶劑的掃描結(jié)果是很難確定三聚氰胺的吸收波長的；況且在色譜分析過程中，通常采用一種以上的溶劑作為流動相，其中的多種小分子與三聚氰胺分子相互作用也會影響三聚氰胺的紫外吸收。這就要求更加全面掌握三聚氰胺在不同流動相中波長的變化，才能找到適合各自色譜條件的檢測波長。

綜上所述，采用高效液相色譜法測定三聚氰胺含量時，在沒有檸檬酸體系的流動相中應(yīng)采用203nm左右或236nm左右的檢測波長；而在有檸檬酸體系的流動相中應(yīng)采用236nm左右的檢測波長。

1 王箴.化工辭典［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000.

2 中國國家標準化委員會.GB／T 22388——2008原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法［S］.北京：中國標準出版社，2008.

3 汪輝，曹小彥，彭新凱，等.高效液相色譜－二極管陣列法測定高蛋白食品中的三聚氰胺［J］.食品與機械，2007，23（5）：114～124.

4 汪輝，彭新凱，曹小彥，等.高效液相色譜測定生鮮乳及乳制品中三聚氰胺的方法研究［J］.食品科學(xué)，2008，29（10）：531～535.

5 丁濤，徐錦忠，李健忠，等.高效液相色譜－二極管陣列檢測法及高效液相色譜－電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測定植物源性蛋白中殘留的三聚氰胺［J］.色譜，2008，26（1）：6～9.

6 賴碧清，鄭曉航，韓銀濤.高效液相色譜－四極桿質(zhì)譜聯(lián)用測定飼料中三聚氰胺含量［J］.飼料工業(yè)，2008，29（4）：47～48.

7 蔣晨陽，范倩，林德清，等.氣質(zhì)聯(lián)用法測定飼料中的三聚氰胺［J］.飼料工業(yè)，2008，29（8）：48～50.

8 張俊燕，何呂興.三聚氰胺的樣品前處理及最新檢測方法［J］.生命科學(xué)儀器，2007，5（10）：57～59.

9 楊勝科，張金平，徐永花，等.蘇丹Ⅲ在不同溶劑中的紫外可見光譜研究［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2007，27（2）：325～328.

10 Gilchrist T L.Heterocyclic Chemistry［M］.2nd ed.New York：Wiley，1992.

11 朱明華.儀器分析［M］.北京：高等教育出版社，2000：270～278.

Ultraviolet absorption spectral of melamine in different mobile phase

CAO Xiao－yan1，2PENG Xin－kai1WANG Hui1HU Zhao－h(huán)ui1LI Ying1XIA Yan－bing2

（1.Changsha Center of Supervision ＆Inspection on Food Quality Safety，Changsha，Hunan410013，China；2.College of Food Science and Technology，Hunan Agriculture University，Changsha，Hunan410128，China）

Ultraviolet absorption spectral of melamine in different mobile phase was studied.The result showed there was different ultraviolet absorption spectral of melamine in different solvents and determination content of melamine in different mobile phase must chose corresponding check wavelength.Finally，wavelength in 203nm or 236nm was chose in none citric acid system and while with wavelength about 236nm in citric acid system.

melamine；mobile phase；ultraviolet absorption spectral；chromatogram

10.3969／j.issn.1003－5788.2011.04.017

曹小彥（1973－），女，長沙市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測中心高級工程師，在讀博士。E－mail：caoxiaoye＠163.com

2011－04－01