摻雜玉米茶葉的基因組DNA提取與PCR檢測方法建立

摘要：根據玉米內源ZEIN基因建立了茶葉中摻雜玉米的普通PCR和實時熒光PCR檢測方法。結果表明，標準CTAB法適合提取茶葉樣品基因組DNA，實時熒光PCR的靈敏度能達到0.1%，普通PCR能達到1%，實時熒光PCR是普通PCR的10倍。兩種方法都能達到檢測要求。

關鍵詞：茶葉（Camellia sinensis）；玉米（Zea mays）；普通PCR；實時熒光PCR；檢測方法

中圖分類號：Q78；S571.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）22-5615-03

目前，我國的茶葉（Camellia sinensis）年消費量已高達66萬t，人均飲茶量0.45 kg/年。茶對我國的社會歷史文化和現實生活都產生了重要影響[1]。茶葉質量安全主要包括茶葉摻假、農藥殘留、重金屬污染、有害微生物污染、磁性物和粉塵污染等因素[2，3]。其中茶葉中摻假的問題近年來越發嚴重，一些不法商販為了獲取高額利潤在茶葉中摻雜各種谷類物質，以次充好，以假冒真。茶葉摻假的方式有：以類似茶葉的其他植物葉冒充茶葉；在真茶葉中摻入假、次茶葉；曬干飲用過的茶葉重新銷售等[4]。此外，茶葉中還出現了摻淀粉、甘薯粉、面粉或其他谷類淀粉加水、加熱促成淀粉糊，于茶葉初制或再加工過程中加入，其目的或是將末茶重新造形，促成條狀；或是將粗老茶特別是回籠茶（泡過的茶葉）揉成條，并增進重實感；或是利用淀粉糊的黏性，摻入一些沙土、木灰、煤屑等以增重；或上述摻偽兼而有之[5]。

PCR技術具有快速、靈敏、特異性高的特點[6]，已廣泛應用于食品、飼料中外源成分的檢測。本研究根據玉米（Zea mays）內源ZEIN基因建立了茶葉中摻雜玉米的普通PCR和實時熒光PCR檢測方法，以期能夠快速、準確地檢測出茶葉中摻雜的玉米。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶葉和玉米購自寧波市歐尚超市散裝商品（樣品在小型食品加工機中充分加工成細粉）。Taq DNA聚合酶和dNTPs等PCR試劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 基因組DNA的提取

稱取含有10%玉米的茶葉樣品200 mg和純玉米樣品20 mg分別采用標準CTAB法[7]、改良CTAB法[8]和試劑盒法提取兩種樣品基因組DNA，用U-0080D型生物分光光度計測定基因組DNA濃度。

1.3 不同濃度梯度玉米的茶葉樣品基因組DNA的提取

將玉米樣品摻入到茶葉中，分別配制成濃度為10.0%、3.0%、1.0%和0.1%的茶葉樣品，并利用標準CTAB法提取基因組DNA，用U-0080D型生物分光光度計測定基因組DNA濃度。

1.4 PCR 擴增

1）實時熒光PCR擴增[9]。實時熒光PCR擴增體系參照One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit說明。20 μL反應體系為：20 μmol/L 上、下游引物各0.4 μL、20 μmol/L熒光探針0.8 μL、50×ROX Reference Dye 0.4 μL、2×TaKaRa Premix Ex Taq 10.0 μL、Rnase-free water 4.0 μL，DNA模板4.0 μL。每樣品設一個平行反應，并設置陰性對照與空白對照。反應程序為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，40個循環。

2）普通PCR擴增[10，11]。普通PCR反應體系為：20 μmol/L上、下游引物各0.4 μL、Rnase-free water 5.2 μL、2×Taq Mastermix 10.0 μL，最后加入4.0 μL DNA模板，總體積20 μL。每樣品設一個平行反應，并設置陰性對照與空白對照。反應程序為：94 ℃預變性5 min； 94 ℃變性30 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，40個循環；72 ℃延伸7 min。

實時熒光PCR擴增結束后在ABI Prism 7000中觀察并記錄結果；普通PCR擴增反應結束后，PCR擴增產物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在GelDoc-EQ（Bio-Rad）凝膠成像系統上觀察并記錄結果。

2 結果與分析

2.1 3種方法提取含10.0%玉米的茶葉樣品基因組DNA濃度和純度

由表1可知，試劑盒法提取的基因組DNA濃度較低，純度與另外兩種方法相差不大，改良CTAB法提取的基因組DNA的濃度和純度比標準CTAB法提取的基因組DNA的濃度和純度都要高，但相差不大。

2.2 茶葉樣品普通PCR和實時熒光PCR擴增結果

3種提取方式都有清晰而明顯的擴增條帶，其中標準CTAB法得到的基因組DNA擴增條帶最亮（圖1A）。標準CTAB法和改良CTAB法提取得到的基因組DNA都有明顯的擴增曲線（圖1B）。結合DNA濃度檢測結果，3種方法提取到的基因組DNA純度相近，但標準CTAB法和改良CTAB法提取得到的基因組DNA濃度更高。而標準CTAB法更加簡潔，所用時間更短，因此確定了最適合的提取方法為標準CTAB法。

含1.0%、3.0%和10.0%玉米的茶葉樣品DNA有擴增條帶，而含0.1%玉米的基因組DNA沒有擴增條帶（圖2A），因此普通PCR能達到的檢測靈敏度為1.0%。含0.1%、1.0%、3.0%和10.0%玉米的基因組DNA都有顯著擴增曲線（圖2B），因此實時熒光PCR的靈敏度能達到0.1%，是普通PCR的10倍。

3 小結與討論

本研究以建立茶葉中摻雜玉米成分的普通PCR和實時熒光PCR兩種檢測方法為目標，優化了核酸提取的方法。結果表明，標準CTAB法提取的DNA純度和得率都較高；改良CTAB法提取的DNA純度和得率也都較高，與標準CTAB法提取的DNA純度和得率差異不大，但是其耗費時間更長，所用試劑更多；試劑盒法提取的DNA雖然純度和其他兩種方法的差異不大，所用時間更短，但是其得率不高且成本較高。因此確定了標準CTAB法為最適合的核酸提取方法。實時熒光PCR方法檢測茶葉中摻雜玉米成分的優點在于：①對玉米目的基因進行擴增后，不再需要凝膠電泳檢測，縮短了檢測時間，且不再需要接觸到EB；②準確性很高，不容易出現假陽性，特異性更強[12]。實時熒光PCR的靈敏度能達到0.1%，普通PCR能達到1.0%，實時熒光PCR是普通PCR的10倍。

參考文獻：

[1] 朱永興.茶的功效及其運用（一）[J].中國茶葉加工，2010，（3）：43-45.

[2] 劉聲傳，羅顯揚.茶葉質量安全生產與可持續發展研究[J].貴州茶葉，2010，38（2）：3-5.

[3] 梅 峰.國際茶市現狀與中國茶產業的發展[J].中國茶葉加工，2009，1（3）：326.

[4] 顏 琪.茶葉中摻假怎樣鑒別檢驗[J].監督與選擇，2006（1）：23.

[5] 林瑞勛.茶中摻淀粉的快速檢驗[J].福建茶葉，1992（1）：29.

[6] TURNI C，PYKE M，BLACKALL P J.Validation of a real-time PCR for Haemophilus parasuis[J]. Journal of Applied Microbiology，2010，108（4）：1323-1331.

[7] 陶 李，張富麗，宋 君.轉基因玉米檢測中4種DNA提取方法比較[J].現代農業科技，2011（12）：52-53.

[8] 黃永蓮，劉 媛，黃真池.植物總DNA的提取方法的改進[J].湛江師范學院學報，2007，28（3）：105-111.

[9] SN/T1196-2003，玉米中轉基因成分定性PCR檢測方法[S].

[10] SPAGNUOLO-EAVER M，WALKER I，CAMPBELL S，et al.Rapid detection of porcine reproductive and respiratory syndrome viral nucleic acid in blood using a fluorimeter based PCR method[J]. Veterinary Microbiology，2000，76（1）：15-23.

[11] 郭 慶，王忠躍，孔繁芳，等.實時熒光定量PCR在植物害蟲研究中的應用[J].江西植保，2011，34（2）：48-53.

[12] 丁遠杰.實時熒光PCR檢測轉基因農產品的研究[D]. 長沙：湖南農業大學，2004.

（責任編輯 屠 晶）