蔊菜幼苗抗菌核病及抗旱和耐濕特性的鑒定

涂玉琴，戴興臨，涂偉鳳，湯 潔

(江西省農業科學院作物研究所，江西 南昌 330200)

隨育種工作的不斷深入及生態環境的持續破壞，加之長期的定向選擇，現有作物栽培品種間和種內可利用的基因資源十分有限，基因等位性變異越來越少，遺傳脆弱性不斷增加，以致作物現有品種的抗性較差、產量較低。因而，尋找新的優異基因資源對于改良作物的品質和抗耐性、提高育種效率以及培育有突破性的新品種具有十分重要的意義。

在油菜(Brassica napus L.)和許多蔬菜所屬的十字花科(Brassicaceae)植物中遺傳資源非常豐富，有很多可供相關作物遺傳改良的有利性狀，如抗病蟲、耐鹽堿、抗旱、耐濕和高含油量等，是一個寶貴的基因庫，有巨大挖掘潛力，對油菜等十字花科作物的遺傳改良和種質創新具有重要意義。蔊菜〔Rorippa indica (L.)Hiern〕為十字花科蔊菜屬(Rorippa Scop.)的一、二年生草本植物，具有抗耐性好和每角結實率高(每角籽粒數平均達70余粒，顯著高于普通油菜品種)等優良性狀［1－2］，是非常有利用價值的基因資源。許多研究者通過遠緣雜交和原生質體融合等方式將蔊菜的優良性狀導入油菜中，創建新的種質資源，以期為油菜品種的遺傳改良提供中間材料［2－4］。但是，迄今尚未見蔊菜相關抗耐性鑒定的研究報道。

作者以長江中下游區域種植面積較大的3個甘藍型油菜品種‘中油821’(‘Zhongyou No.821’)、‘中雙9號’(‘Zhongshuang No.9’)及‘中油雜2號’(‘Zhongyouza No.2’)為對照，采用離體葉片菌絲塊接種法和人工模擬干旱、濕害脅迫處理法對蔊菜的抗耐性進行鑒定，對其抗旱、耐濕和抗菌核病等特性進行評價，為蔊菜相關抗耐性基因的研究和利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

供試蔊菜采自江西省農業科學院作物研究所試驗地(南昌蓮塘)；甘藍型油菜品種‘中油821’、‘中雙9號’及‘中油雜2號’由中國農科院油料作物研究所提供。其中，‘中油821’具抗菌核病［5－6］特點；‘中雙9號’具抗菌核病［7］、耐濕性強［8－9］、抗旱性強［10］的特點；‘中油雜2號’具抗菌核病［11］的特點。

1.2 方法

1.2.1 菌核病抗性鑒定 采用離體葉片菌絲塊接種法［12－14］進行菌核病〔Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary〕抗性鑒定，實驗于2009年12月在江西省農業科學院油料作物重點實驗室進行。將取自大田植株上的菌核病菌核用體積分數75％乙醇處理1 min，無菌水沖洗1～2次，然后用質量體積分數0.1％HgCl2溶液處理10 min，再用無菌水沖洗3～4次后，接種在PDA培養基上，置于20℃暗培養1～2 d；菌核萌發后，取菌落外圍菌絲接種于裝有PDA培養基的培養皿(直徑9 cm)中繼代1次，待菌絲布滿整個培養皿時用直徑4 mm打孔器打取菌塊用于接種。

于苗期隨機選擇20株長勢一致的蔊菜幼苗，每株選取中下部新鮮葉片2片，共40片；3個甘藍型油菜品種幼苗每株選取中下部生長較為一致的新鮮葉片2片，每個油菜品種各20片。將菌絲塊長有菌絲的一面貼于展開的葉片表面，蔊菜葉片每片接種1個菌絲塊，3個油菜品種的葉片則每片接種2個菌絲塊；接種后的葉片平展擺放于鋪有3～4層濕潤濾紙的大塑料盆中，蓋上塑料布保濕，置于25℃培養室中暗培養，72 h后測量病斑直徑。

1.2.2 抗旱性和耐濕性鑒定 于2009年10月至2010年1月在江西省農業科學院作物研究所試驗大棚內采用盆栽法［15－16］進行抗旱性實驗。栽培盆高20 cm、直徑25 cm，盆栽土為大田栽培土，碎土后攤開晾曬2 d，并翻動數次，確保土壤含水量一致；播種前拌入適量多菌靈粉末滅菌，每盆分裝干土6.0 kg (土壤含水量約7％)，并加水700 mL，使盆栽土最終含水量為16.7％。2009年10月中下旬播種，出苗后視土壤墑情定量澆水，每次每盆澆水300 mL，使盆栽土含水量保持在約15％。3葉期定苗，每盆4株。

在7～8片真葉期(2010年1月6日)選取長勢較為一致的盆栽苗進行干旱處理(即不澆水處理25 d)，以正常澆水(視土壤墑情等量澆水)為對照，干旱處理和對照各設置3次重復，每重復3盆。2010年1月31日處理結束后參照文獻［17］的方法取樣統計并測定單株的總葉片數、綠葉數、黃葉數、莖粗、根長以及地上部分、根和全株的鮮質量及干質量等指標。莖粗采用游標卡尺測定植株子葉結部位的直徑。用吸水紙擦去植株表面水分后，將地上部分和根分開，分別稱取鮮質量，然后于160℃殺青處理1 h并在70℃恒溫條件下干燥至恒質量，分別稱取干質量。根據對照組及處理組各指標的測定值計算傷害指數(damage index，DI)，DI=〔(對照值－處理值)/對照值〕×100％［17－18］。

在6～7片真葉期(2009年12月27日)進行濕害處理，使盆栽土表保持1～2 cm的淺水層［17，19－20］，處理35 d［17］，以上述正常澆水為對照，重復3次，每重復3盆。2010年1月31日處理結束后取樣，測定指標與抗旱性實驗一致并計算各指標的傷害指數。

1.3 數據統計處理

采用Excel 2003和SPSS 13.0軟件對實驗數據進行處理和分析。

2 結果和分析

2.1 蔊菜離體葉片對菌核病的抗性

甘藍型油菜品種‘中油821’、‘中雙9號’和‘中油雜2號’以及蔊菜離體葉片接種菌核病菌絲后的形態見圖1，病斑直徑的統計結果見表1。經菌核病侵染的‘中油821’、‘中雙9號’、‘中油雜2號’和蔊菜離體葉片的病斑直徑分別為3.60、3.36、3.25和1.75 cm。蔊菜離體葉片的病斑直徑極顯著小于3個油菜品種，為3個油菜品種病斑直徑的48.61％ ～53.85％。此外，作者多年的田間觀察結果顯示：蔊菜葉片對菌核病的自然感病率為0％。因此，蔊菜對菌核病的抗性顯著高于甘藍型油菜品種，是可深度利用的菌核病抗性基因資源。

2.2 蔊菜幼苗的抗旱性和耐濕性

經干旱和濕害脅迫處理后蔊菜及甘藍型油菜品種‘中油821’、‘中雙9號’和‘中油雜2號’幼苗的各項生長指標的變化見表2。

圖1 經菌核病侵染后蔊菜和3個甘藍型油菜品種離體葉片的形態Fig.1 M orphology of leaves in vitro of Rorippa indica(L.)Hiern and three cultivars of Brassica napus L.after infected by Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary

表1 經菌核病侵染后蔊菜和3個甘藍型油菜品種離體葉片病斑直徑的比較(±SE)Table 1 Comparison of lesion spot diameter in leaves in vitro of Rorippa indica(L.)Hiern and three cultivars of Brassica napus L.after infected by Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary(±SE)

表1 經菌核病侵染后蔊菜和3個甘藍型油菜品種離體葉片病斑直徑的比較(±SE)Table 1 Comparison of lesion spot diameter in leaves in vitro of Rorippa indica(L.)Hiern and three cultivars of Brassica napus L.after infected by Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary(±SE)

1)＊＊：蔊菜與3個供試油菜品種間差異極顯著(P＜0.01)The difference between R.indica and three cultivars of B.napus is highly significant(P＜0.01).

樣品Sample 病斑直徑/cm1) Diameter of lesion spot1)中油821 Zhongyou No.821 3.60±0.43中油雜2號Zhongyouza No.2 3.25±0.44中雙9號Zhongshuang No.9 3.36±0.24蔊菜R.indica 1.75±0.41＊＊

2.2.1 蔊菜幼苗的抗旱性 在停止澆水(即干旱脅迫處理)7 d后，3個甘藍型油菜品種幼苗出現萎蔫狀況，而蔊菜植株未發生萎蔫現象。干旱脅迫結束時，3個油菜品種幼苗出現嚴重萎蔫，總葉片數和綠葉數較對照明顯減少、黃葉數增加，總葉片數7.88～10.59片、綠葉數3.46～5.29片，分別為對照的75.92％～86.45％和47.72％ ～58.78％；黃葉數4.42～5.50片，為對照的1.41～1.63倍。而在干旱脅迫結束時蔊菜幼苗葉片僅出現輕度萎蔫，總葉片數22.13片、綠葉數19.75片，分別為對照的84.02％和79.00％；黃葉數2.38片，為對照的1.79倍。

表2結果顯示：經干旱脅迫處理后，3個甘藍型油菜品種幼苗的莖粗、根長以及地上部分、根和全株的鮮質量和干質量均極顯著低于對照(P＜0.01)，其中，干旱脅迫對3個甘藍型油菜品種幼苗地上部分、根和全株的鮮質量影響較大，傷害指數分別為76.92％～82.47％、71.68％～76.69％和76.19％～81.27％；對莖粗、根長以及地上部分、根和全株的干質量影響較小，傷害指數分別為41.55％～44.49％、24.19％～36.46％、32.13％ ～43.75％、49.50％ ～54.03％和36.79％～44.99％。

經干旱脅迫后，蔊菜幼苗的莖粗和根鮮質量分別極顯著和顯著低于對照，傷害指數分別為17.90％和25.13％，均極顯著小于3個甘藍型油菜品種。蔊菜幼苗的根長、地上部分和全株鮮質量均較對照有不同程度的減少，但與對照間的差異不顯著，而這3個指標的傷害指數分別僅為9.33％、26.78％和26.39％，均顯著或極顯著小于3個甘藍型油菜品種。蔊菜幼苗根干質量與對照相比沒有變化，傷害指數為0％，極顯著低于3個甘藍型油菜品種。蔊菜幼苗地上部分和全株的干質量均較對照有所增加，但差異不顯著，傷害指數分別為－17.14％和－11.36％，推測與蔊菜的抗旱性以及實驗的誤差有關。

上述分析結果表明：干旱脅迫處理后，蔊菜幼苗各生長指標的傷害指數均顯著或極顯著低于3個甘藍型油菜品種，表明蔊菜的抗旱性顯著高于3個甘藍型油菜品種。

2.2.2 蔊菜幼苗的耐濕性 經濕害脅迫后，3個甘藍型油菜品種幼苗的葉片葉緣先失綠且呈紫紅色，然后為黃褐色，且失綠面積逐漸擴大，直至整個葉片失綠而凋零；而蔊菜幼苗在濕害脅迫條件下葉片葉緣變黃色，黃斑面積逐漸擴大，直至整個葉片變黃而凋零。濕害脅迫處理結束時，蔊菜和3個甘藍型油菜品種幼苗的總葉片數和綠葉數均明顯少于對照、黃葉數增加，但蔊菜幼苗的黃葉數顯著小于3個甘藍型油菜品種，3個甘藍型油菜品種幼苗的黃葉數為4.50～5.25片，蔊菜幼苗的黃葉數為2.50片。

表2結果還顯示：經濕害脅迫處理后，3個甘藍型油菜品種幼苗的莖粗、根長及地上部分、根和全株的鮮質量以及根和全株的干質量均極顯著低于對照；‘中油821’幼苗地上部分干質量也低于對照但差異不顯著，‘中雙9號’和‘中油雜2號’幼苗地上部分的干質量均顯著或極顯著低于對照。濕害脅迫處理對油菜幼苗根的鮮質量和干質量的傷害較嚴重，傷害指數分別為56.9％～70.62％和62.90％～74.26％，而對莖粗、根長以及地上部分和全株的鮮質量及干質量的傷害較小，傷害指數分別為32.61％～38.39％、27.02％ ～49.57％、35.30％ ～49.21％、40.25％ ～52.64％、12.60％～27.17％和25.00％～37.31％。

經濕害脅迫處理后，蔊菜幼苗的莖粗、根長和根干質量均顯著低于對照，傷害指數分別僅為12.00％、13.17％和20.99％，顯著或極顯著小于3個甘藍型油菜品種。蔊菜幼苗地上部分、根和全株的鮮質量以及地上部分和全株的干質量均低于對照但差異不顯著，傷害指數分別為25.76％、7.95％、21.66％、27.14％和24.55％；除地上部分干質量外，其他生長指標的傷害指數均顯著或極顯著低于3個甘藍型油菜品種。

經濕害脅迫處理后，3個甘藍型油菜品種和蔊菜幼苗的根系生長受到明顯抑制，根長以及根的鮮質量和干質量均有不同程度減少，尤其是3個甘藍型油菜品種的幼苗根系喪失活力、甚至腐爛(圖2)；而蔊菜幼苗的根系經濕害脅迫處理后雖然生長受到抑制但未出現大量根系腐爛的現象(圖2)。

表2 干旱和濕害脅迫對蔊菜和3個甘藍型油菜品種幼苗生長指標的影響1)Table 2 Effects of drought and waterlogging stresses on grow th indexes of seedlings of Rorippa indica(L.)Hiern and three cultivars of Brassica napus L.1)

上述分析結果表明：與3個甘藍型油菜品種幼苗相比，蔊菜幼苗對濕害脅迫具有一定的耐性。

3 討 論

圖2 經濕害脅迫處理后蔊菜和3個甘藍型油菜品種的形態比較Fig.2 M orphology com parison of Rorippa indica(L.)Hiern and three cultivars of Brassica napus L.treated by waterlogging stress

油菜菌核病是世界范圍內的一種主要病害，居中國油菜三大病害之首，以長江流域發病最為嚴重，發病較輕年份可致減產10％～20％，發病嚴重年份可致減產50％以上［21］。長期以來，人們在該病害的防控方面做了大量的研究工作，并在藥劑防治等方面取得了一定的成效，但仍未能有效改變油菜菌核病危害嚴重的局面［22］。實踐證明，選育抗菌核病品種是減輕其危害的最有效手段［23］，但是，迄今未發現對菌核病具有完全抗性或免疫的油菜種質資源。因此，迫切需要發掘和創造抗(耐)菌核病的種質資源，而從野生近緣種中發掘抗(耐)病基因源并轉移和利用其抗性基因是油菜抗菌核病種質創新的重要手段。離體葉片菌絲塊接種法是應用較為廣泛的菌核病抗性鑒定方法之一［14，24］，已經廣泛用于油菜抗病種質篩選、新品種和遺傳群體的抗性鑒定等方面［7，13－14，25］。本研究結果表明：菌核病菌接種后蔊菜幼苗離體葉片病斑直徑極顯著小于3個甘藍型油菜品種，因此，蔊菜是一種可利用的高抗菌核病的基因源。

干旱和濕害一直是我國油菜生產中影響較大的自然因素。西南、華北等油菜產區在油菜生長前期雨水偏少、冬旱頻繁，例如2010年西南地區受旱耕地面積達到7.3×1010hm2，油菜和小麥(Triticum aestivum L.)等冬季作物受災嚴重；長江流域產區在油菜生長后期雨水偏多，且主要采用“水稻(Oryza sativa L.)－油菜”輪作模式，地下水位高、土壤黏重，常發生濕害，加之全年降水量不均勻，容易導致季節性干旱(如秋旱和春旱)，嚴重影響油菜的產量和種植面積［10，17，26］。因此，發掘和創造抗旱、耐濕種質，改良現有油菜品種的抗旱性及耐濕性，是我國油菜產業發展的迫切需求，已引起研究者的廣泛關注［8－10，15，17，20，27］。

干旱脅迫直接影響植物的生長發育和生理代謝，可導致植株矮小以及生物量和產量降低［28－30］。因此，對干旱脅迫后植株鮮質量和干質量等形態學指標進行評價，是鑒定植物抗旱性的主要方法［28，30］。作者對干旱脅迫后3個甘藍型油菜品種和蔊菜幼苗的莖粗、根長以及地上部分、根和全株的鮮質量和干質量等8個生長指標進行了比較，結果顯示：干旱脅迫后3個甘藍型油菜品種幼苗的生長指標極顯著低于對照，而蔊菜幼苗僅莖粗和根鮮質量分別極顯著和顯著低于對照，且蔊菜幼苗各指標的傷害指數均顯著或極顯著小于3個甘藍型油菜品種。由此可見，干旱脅迫對3個甘藍型油菜品種的影響顯著大于蔊菜，蔊菜的抗旱性較強，但其抗旱機制尚有待進一步研究。

濕害使油菜根際缺氧，導致能量代謝途徑發生變化，從而釋放大量的有害物質，引起根系活力下降，葉片凋零死亡，株高、根長及植株鮮質量和干質量等性狀顯著下降［17］，因此，濕害后植株根系、葉片、鮮質量和干質量等性狀已經成為植物耐濕性評價鑒定的重要指標［17，31－32］。在濕害脅迫后3個甘藍型油菜品種幼苗根系相關指標降低幅度最大，這與前人的研究結果類似［17，20，32］，可見濕害對3個甘藍型油菜品種幼苗根系影響較大；而蔊菜幼苗根干質量、根長和莖粗等生長指標顯著下降，但其他指標下降不明顯。對蔊菜和3個甘藍型油菜品種幼苗各指標的傷害指數進行比較分析，結果顯示：蔊菜幼苗8項指標的傷害指數均低于油菜品種，且其中7項指標的差異達到顯著或極顯著水平。值得注意的是，在濕害脅迫處理后3個甘藍型油菜品種幼苗根系喪失活力、且大多腐爛；而蔊菜根系則僅表現為生長受到抑制，未出現大量根系腐爛的情況。因此，蔊菜的耐濕能力顯著高于3個甘藍型油菜品種。蔊菜的根系活力很強，長期浸泡水中也沒有大范圍腐爛，這是蔊菜耐濕性顯著高于普通油菜的重要原因之一，而其耐濕機制則有待進一步的系統研究和闡述。

研究結果表明：蔊菜是十字花科植物中對菌核病抗性強、抗旱耐濕的優異基因源之一，可為油菜等十字花科作物的抗病性、抗逆性等性狀的遺傳改良提供新的抗性基因。

致謝：在實驗和數據分析過程中得到了江西省農業科學院作物研究所孫建老師和饒月亮老師的大力幫助，謹此致謝!

［1］中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志：第三十三卷［M］.北京：科學出版社，1987：300－304.

［2］戴興臨，程春明，宋來強，等.油菜×蔊菜遠緣雜交創新油菜種質資源研究［J］.植物遺傳資源學報，2005，6(2)：242－244.

［3］戴興臨，程春明，潘 斌，等.油菜與蔊菜遠緣雜交親和性研究初報［J］.江西農業學報，2001，13(1)：60－61.

［4］姜淑慧，管榮展，唐三元，等.甘藍型油菜與蔊菜的原生質體融合與植株再生［J］.遺傳，2007，29(6)：745－750.

［5］賀源輝，楊瑞芳，羅時清.多抗性高產油菜新品系821的選育及其性狀結構的研究［J］.中國油料，1987，9(2)：11－15.

［6］賀源輝，陳秀芳.多抗(耐)性油菜新品種中油821的推廣應用和前景［J］.中國油料，1989，11(3)：1－5.

［7］王漢中，劉貴華，鄭元本，等.抗菌核病雙低油菜新品種中雙9號選育及其重要防御酶活性變化規律的研究［J］.中國農業科學，2004，37(1)：23－28.

［8］叢 野，程 勇，鄒崇順，等.甘藍型油菜發芽種子耐濕性的主基因+多基因遺傳分析［J］.作物學報，2009，35(8)：1462－1467.

［9］張學昆，范其新，陳 潔，等.不同耐濕基因型甘藍型油菜苗期對缺氧脅迫的生理差異響應［J］.中國農業科學，2007，40(3)： 485－491.

［10］楊春杰，程 勇，鄒崇順，等.模擬干旱脅迫下不同甘藍型油菜品種發芽能力的配合力與遺傳效應分析［J］.作物學報，2008，34(10)：1744－1749.

［11］李云昌，李英德，徐育松，等.高產雙低雜交油菜新品種中油雜2號的選育［J］.中國油料作物學報，2002，24(2)：73－75.

［12］Cruickshank R H.Distinction between Sclerotinia species by their pectic zymograms［J］.Transactions of the British Mycological Society，1983，80(1)：117－119.

［13］李愛民，張永泰，蔣金金，等.白芥和甘藍型油菜屬間雜種后代菌核病抗性鑒定［J］.中國油料作物學報，2009，31(2)： 249－252.

［14］冉 毅，文成敬，牛應澤.油菜菌核病抗性鑒定方法的比較及抗源的篩選［J］.植物保護學報，2007，34(6)：601－606.

［15］耿站軍，鐘 穎，楊瑞吉.水分脅迫對不同基因型油菜的生態適應性影響［J］.干旱地區農業研究，2008，26(6)：159－162.

［16］何 瑋，范 彥，徐遠東，等.紅三葉苗期抗旱性指標篩選及綜合評價［J］.植物遺傳資源學報，2009，10(4)：572－577.

［17］宋豐萍，胡立勇，周廣生，等.漬水時間對油菜生長及產量的影響［J］.作物學報，2010，36(1)：170－176.

［18］黎 裕，王天宇，劉 成，等.玉米抗旱品種的篩選指標研究［J］.植物遺傳資源學報，2004，5(3)：210－215.

［19］孫 建，張秀榮，張艷欣，等.濕害處理對不同生育時期芝麻葉片保護酶活性和種子產量的影響［J］.應用與環境生物學報，2009，15(6)：790－795.

［20］李 真，蒲圓圓，高長斌，等.甘藍型油菜DH群體苗期耐濕性的評價［J］.中國農業科學，2010，43(2)：286－292.

［21］官春云，李方球，李 栒，等.雙低油菜湘油15(B.napus)對菌核病抗性的研究［J］.作物學報，2003，29(5)：715－718.

［22］張志元，官春云.油菜對菌核病抗(耐)病性鑒定與抗病育種研究進展［J］.湖北農業科學，2003，42(3)：38－43.

［23］Liu S，Wang H，Zhang J，et al.In vitro mutation and selection of doubled-haploid Brassica napus lines with improved resistance to Sclerotinia sclerotiorum［J］.Plant Cell Reports，2005，24(3)： 133－144.

［24］吳純仁，劉后利.油菜菌核病抗(耐)病性篩選方法的研究［J］.植物保護學報，1991，18(4)：323－327.

［25］劉春林，官春云，李 栒，等.油菜分子標記圖譜構建及抗菌核病性狀的QTL定位［J］.遺傳學報，2000，27(10)：918－924.

［26］楊春杰，張學昆，鄒崇順，等.PEG－6000模擬干旱脅迫對不同甘藍型油菜品種萌發和幼苗生長的影響［J］.中國油料作物學報，2007，29(4)：425－430.

［27］唐道城，張 禮，王艷萍，等.白芥及油菜產量性狀抗旱性及抗旱性鑒定指標研究初探［J］.干旱地區農業研究，1999，17 (3)：62－66.

［28］孫彩霞，沈秀瑛.作物抗旱性鑒定指標及數量分析方法的研究進展［J］.中國農學通報，2002，18(1)：49－51.

［29］楊 帆，苗靈鳳，胥 曉，等.植物對干旱脅迫的響應研究進展［J］.應用與環境生物學報，2007，13(4)：586－591.

［30］王艷慧，高洪文，王 贊，等.膠質苜蓿種質資源苗期抗旱性綜合評價［J］.植物遺傳資源學報，2009，10(3)：443－447.

［31］李 真，梅淑芳，劉向蕾，等.作物耐濕澇性研究進展［J］.湖北農業科學，2009，48(11)：2866－2868.

［32］宋豐萍，胡立勇，周廣生，等.地下水位對油菜生長及產量的影響［J］.作物學報，2009，35(8)：1508－1515.