5種杜鵑幼苗對高溫脅迫的生理生化響應(yīng)及耐熱性綜合評價

王凱紅，劉向平，張樂華，①，凌家慧，李 立

(1.江西省·中國科學院廬山植物園，江西廬山332900；2.江西省廬山自然保護區(qū)管理處，江西廬山332900)

中國是全世界杜鵑花屬(Rhododendron L.)植物的起源和分布中心，擁有豐富的杜鵑花野生資源，但這些野生資源多分布于西南高海拔地區(qū)［1］。受遺傳因素的制約，該屬植物喜冷涼、濕潤環(huán)境，耐熱性較差，高溫熱害是制約其遷地保育及園林應(yīng)用的主要限制因子［2］。杜鵑花種類繁多、遺傳資源豐富，不同種間的生態(tài)習性和耐熱性存在較大差異。為了探討杜鵑花屬植物的耐熱機制及不同種間的適應(yīng)性差異，近年來部分學者針對杜鵑花屬植物開展了高溫脅迫實驗，篩選出一批與杜鵑花耐熱性有關(guān)的形態(tài)及生理指標［3-5］。然而，植物耐熱性是受多基因控制的數(shù)量性狀［6］，且受環(huán)境條件的復雜性和植物對高溫脅迫的適應(yīng)性等多因子影響，故僅憑個別或少數(shù)指標的簡單比較難以真實地反映植物耐熱性的遺傳本質(zhì)［7-8］。

主成分分析法可以在不損失或很少損失原有信息的前提下，將原來數(shù)量較多且彼此相關(guān)的指標轉(zhuǎn)換成新的個數(shù)較少且彼此獨立的綜合指標，并在此基礎(chǔ)上計算出供試植物的每個綜合指標值及其相應(yīng)的隸屬函數(shù)值，經(jīng)加權(quán)求和可得到供試植物的抗逆性綜合評價值［9］。近年來，該方法已被應(yīng)用于大白菜(Brassica pekinensis Rupr.)、小麥(Triticum sestivum L.)和水稻(Oryza sativa L.)等農(nóng)作物和一些綠化植物的抗逆性評價，并取得了較為客觀可靠的評價效果［8-11］，但尚未見有關(guān)杜鵑花屬植物耐熱性鑒定與評價方面的研究報道。

為探索和建立快速、有效的杜鵑花耐熱性的鑒定方法，作者對高溫脅迫條件下5種杜鵑花屬植物實生苗的6個生理生化指標進行了測定和相關(guān)性分析，并應(yīng)用主成分分析和隸屬函數(shù)法對5種杜鵑的耐熱性進行了綜合評價，據(jù)此建立了最優(yōu)回歸方程，以期為杜鵑花屬植物耐熱性的鑒定、評價、預測及耐熱種質(zhì)的發(fā)掘和遺傳改良提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試種類有映山紅亞屬〔Subgen.Tsutsusi(G.Don)Pojark.〕的白花杜鵑〔Rhododendron mucronatum (Blume)G.Don〕、馬銀花亞屬(Subgen.Azaleastrum Planch.ex K.Koch)的毛棉杜鵑(R.moulmainense Hook.f.)、羊躑躅亞屬〔Subgen.Pentanthera(G.Don)Pojark.〕的羊躑躅〔R.molle(Blume)G.Don〕、常綠杜鵑亞屬〔Subgen.Hymenanthes(Blume)K.Koch〕的紅灘杜鵑(R.chihsinianum Chun et Fang)和杜鵑亞屬(Subgen.Rhododendron L.)的紅棕杜鵑(R.rubiginosum Franch.)，均為江西省·中國科學院廬山植物園內(nèi)同批播種的4年生實生苗。

2009年4月初，選取大小一致且生長健壯的5種杜鵑的4年生實生苗栽植于高9 cm、上口徑11.5 cm、底徑8.5 cm的塑料盆中，每盆1株，栽培基質(zhì)為當?shù)亓窒碌谋韺痈惩粒寥乐杏袡C質(zhì)和腐殖質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)分別為10.87％和6.63％，速效氮、速效磷和速效鉀的質(zhì)量濃度分別為266.20、22.17和83.65 mg·kg-1，pH 4.79。供試苗置于常溫溫室中培養(yǎng)，采用日常養(yǎng)護管理方法，3個月后進行脅迫實驗。

1.2 方法

1.2.1 高溫脅迫處理方法 分別設(shè)置22℃(對照)、30℃(輕度高溫脅迫)和38℃(重度高溫脅迫) 3組處理；每組處理設(shè)3次重復，每一重復6株苗。實驗在空氣相對濕度80％、光照時間12 h·d-1、光照強度120μmol·m-2·s-1的人工氣候箱中進行。盆底設(shè)置托盤(水深1.0～1.5 cm)補充基質(zhì)水分。脅迫處理6 d后，隨機采集當年生功能葉(成熟葉)，去除中脈；一部分直接用于丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)和脯氨酸(Pro)含量的測定；另一部分置于-70℃保存，用于超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性的測定。

1.2.2 生理生化指標測定方法 MDA含量的測定參照文獻［12］的方法并略加改進。稱取0.5 g新鮮葉片，加入體積分數(shù)20％三氯乙酸與體積分數(shù)0.5％硫代巴比妥酸的等體積混合液5 mL及少許石英砂，研磨至勻漿；沸水浴中保溫30 min后，置于冰浴中迅速冷卻；用3-18K離心機(德國Sigma公司生產(chǎn))于10 000 g離心10 min；取上清液，采用UV-3100PC掃描式紫外可見光分光光度計(上海美譜達公司生產(chǎn))測定450、532和600 nm處的吸光值，根據(jù)下列公式計算樣品中的MDA含量：MDA含量=6.45×(A532-A600)-0.56×A450。

采用文獻［13］的方法測定H2O2含量。于波長390 nm處測定吸光值，并根據(jù)標準曲線方程 y= 70.185x-0.663(x為吸光值，y為H2O2含量)計算樣品中H2O2含量。

Pro含量測定參照文獻［14］的酸性茚三酮法并略加改進。取新鮮葉片0.5 g，加入少許石英砂及5 mL體積分數(shù)3％磺基水楊酸，研磨至勻漿；沸水浴中保溫10 min后，冰浴冷卻，765 g離心10 min；取上清液1 mL，加入1 mL冰乙酸、1 mL蒸餾水和2 mL酸性茚三酮，混勻后置于沸水浴中保溫60 min，冰浴冷卻后加入4 mL甲苯，振蕩30 s，靜置；取上層液于波長520 nm處測定吸光值，并根據(jù)標準曲線方程y= 34.793x+0.140(x為吸光值，y為Pro含量)計算樣品中Pro含量。

采用NBT光還原法［15］測定SOD活性，以抑制50％氮藍四唑(NBT)光化還原為1個酶活力單位；采用紫外分光光度法［16］測定CAT活性，以1 min內(nèi)A240變化0.1為1個酶活力單位；采用文獻［17］的方法測定APX活性，以1 min內(nèi)A290變化0.01為1個酶活力單位。

各指標均重復測定3次，結(jié)果取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

主成分分析參照曾憲海等［18］及張云等［19］的方法。首先對各指標的原始數(shù)據(jù)進行標準化；計算各指標間的相關(guān)系數(shù)矩陣以及主成分貢獻率和累計貢獻率，并按累計貢獻率大于或等于85％確定主成分個數(shù)；根據(jù)相關(guān)系數(shù)矩陣與初始因子載荷矩陣之間的關(guān)系求出特征向量矩陣(系數(shù)矩陣)；建立主成分方程表達式并計算綜合指標值。

依據(jù)文獻［8-9］中的公式計算5種杜鵑在不同溫度條件下各綜合指標的隸屬函數(shù)值U(xj)、各綜合指標的權(quán)重Wj和各種類的耐熱綜合評價值D。

實驗過程中的數(shù)據(jù)處理、相關(guān)性分析、主成分分析、隸屬函數(shù)計算和逐步回歸分析等均運用Excel 2007和SPSS 17.0軟件完成。

2 結(jié)果和分析

2.1 高溫脅迫條件下5種杜鵑生理生化指標的變化分析

2.1.1 生理生化指標的比較分析 高溫脅迫條件下，5種杜鵑丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)和脯氨酸(Pro)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性的測定結(jié)果見表1。由表1數(shù)據(jù)可見：與對照(22℃)相比，30℃和38℃高溫脅迫條件下5種杜鵑葉片的各項生理生化指標均發(fā)生了變化，其中MDA、H2O2和Pro含量以及CAT和APX活性均隨處理溫度的升高而增加；在30℃脅迫條件下，SOD活性略高于對照，而在38℃脅迫條件下則低于對照。

由表1還可見：高溫脅迫條件下5種杜鵑葉片各項生理生化指標的變化幅度均存在較大差異，因而無法采用某一單項指標評價供試5種杜鵑的耐熱性強弱，也說明植物的耐熱性是一個復雜的綜合性狀。

2.1.2 生理生化指標的相關(guān)性分析 高溫脅迫條件下，5種杜鵑6個生理生化指標的相關(guān)性分析結(jié)果見表2。由表2可以看出：6個生理生化指標間均存在著一定的相關(guān)性，其中有些指標間的相關(guān)性達到了顯著或極顯著的水平。SOD活性與APX活性呈顯著負相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)，與H2O2和Pro含量及CAT活性呈負相關(guān)關(guān)系；其他指標間均呈正相關(guān)關(guān)系。其中，CAT活性與H2O2和Pro含量及APX活性間均呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)，APX活性與Pro含量呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)，從而使得它們所提供的信息發(fā)生了重疊。因此，直接利用這些指標難以準確地評價5種杜鵑種間的耐熱性強弱，需要應(yīng)用主成分分析方法。

表1 高溫脅迫條件下5種杜鵑生理生化指標的測定結(jié)果(±SD)Table 1 Determ ination result of physiological-biochem ical indexes of five species in Rhododendron L.under high tem perature stress(±SD)

表1 高溫脅迫條件下5種杜鵑生理生化指標的測定結(jié)果(±SD)Table 1 Determ ination result of physiological-biochem ical indexes of five species in Rhododendron L.under high tem perature stress(±SD)

種類Species 溫度/℃Temperature丙二醛含量/μmol·g-1 MDA content過氧化氫含量/μmol·g-1 H2O2 content脯氨酸含量/μg·g-1 Pro content超氧化物歧化酶活性/U·g-1 SOD activity過氧化氫酶活性/U·g-1·min-1 CAT activity抗壞血酸過氧化物酶活性/U·g-1·min-1 APX activity白花杜鵑 22 0.056 5±0.000 2 1.260±0.008 64.255±4.986 380.156±0.623 247.222±12.647 1 916.667±35.119 R.mucronatum 30 0.062 5±0.000 7 1.324±0.041 79.912±6.714 384.642±4.398 325.208±10.652 2 270.000±103.923 38 0.073 3±0.000 7 1.728±0.052 165.387±4.810 375.671±0.623 445.000±10.929 5 096.667±50.332毛棉杜鵑 22 0.093 9±0.000 4 1.198±0.035 56.485±3.917 375.399±2.092 213.889±15.486 1 573.333±110.604 R.moulmainense 30 0.100 4±0.003 9 1.418±0.077 73.997±5.234 378.661±1.311 267.222±26.995 1 816.667±153.731 38 0.110 0±0.006 1 1.946±0.017 88.379±1.392 368.739±1.883 325.833±27.550 4 966.667±150.444羊躑躅 22 0.025 2±0.000 2 1.229±0.022 67.619±2.109 353.109±2.825 229.722±31.195 1 610.000±147.309 R.molle 30 0.032 6±0.000 4 1.405±0.043 87.915±6.109 362.895±5.334 280.278±11.375 2 166.667±140.119 38 0.049 1±0.001 8 1.939±0.048 141.728±4.322 341.556±4.473 405.556±15.642 4 193.333±161.967紅灘杜鵑 22 0.047 1±0.000 2 0.724±0.012 65.067±4.053 378.933±0.849 229.444±14.561 1 550.000±60.000 R.chihsinianum 30 0.053 7±0.004 4 1.001±0.057 89.422±3.760 381.516±2.092 266.667±15.207 1 853.333±70.946 38 0.072 6±0.003 2 1.133±0.042 169.678±4.850 370.234±0.706 309.167±16.415 3 680.000±138.564紅棕杜鵑 22 0.054 0±0.000 7 0.501±0.021 54.745±3.427 362.895±0.815 232.917±9.419 2 316.667±110.151 R.rubiginosum 30 0.076 7±0.002 2 0.824±0.047 78.868±6.982 363.846±1.698 262.944±10.809 2 736.667±141.892 38 0.089 2±0.002 9 1.023±0.056 93.134±5.722 334.217±14.185 316.944±12.919 6 150.000±141.067

表2 高溫脅迫條件下5種杜鵑生理生化指標的相關(guān)性分析1)Table 2 Correlation analysis of physiological-biochem ical indexes of five species in Rhododendron L.under high tem perature stress1)

2.1.3 生理生化指標的主成分分析 高溫脅迫條件下供試5種杜鵑6個生理生化指標的主成分分析結(jié)果見表3。表3數(shù)據(jù)顯示：前3個綜合指標的貢獻率分別為52.01％、19.20％和16.31％，累計貢獻率達87.52％。表明前3個綜合指標反映了原指標的絕大部分信息，可以代替原來6個生理生化指標對5種杜鵑的耐熱性進行綜合評價。將前3個綜合指標分別定義為第1、第2和第3主成分，根據(jù)杜鵑6個測定指標的標準化值和綜合指標的標準化特征向量(表3)，可得到第1、第2和第3主成分的回歸方程，分別為： CI(1)=0.186 2X1+0.409 8X2+0.464 7X3-0.228 7X4+ 0.527 0X5+0.501 0X6；CI(2)=0.655 0X1+0.244 1X2-0.049 4X3+0.707 2X4+0.015 8X5-0.091 3X6；CI(3)= -0.623 9X1+0.268 0X2+0.352 9X3+0.456 0X4+ 0.255 8X5-0.376 2X6。

主成分特征向量為各主成分表達式中的原始變量標準化值的系數(shù)向量，它們代表了各變量對相應(yīng)的主成分作用權(quán)數(shù)，即各單項指標對綜合指標的貢獻大小。由主成分方程式及表3結(jié)果可知：第1主成分特征向量較大的是CAT和APX活性，其次是Pro和H2O2含量；第2主成分特征向量最大的是SOD活性，其次是MDA含量；第3主成分中絕對值最大的特征向量是MDA含量(為負值)，其次是SOD活性。高溫脅迫條件下CAT和APX活性及Pro含量的增加均有利于活性氧的清除和維持細胞膜的穩(wěn)定，因此第1主成分主要反映了高溫脅迫條件下植物體內(nèi)清除H2O2的能力，可定義為H2O2清除因子。SOD是清除O-·2的關(guān)鍵酶，對減輕活性氧引發(fā)的膜脂過氧化傷害具有保護作用，而MDA是膜脂過氧化作用的最終產(chǎn)物，也是衡量膜系統(tǒng)受害程度的重要指標，故第2和第3主成分可定義為維持生物膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的因子。

表3 高溫脅迫條件下5種杜鵑生理生化指標的主成分分析結(jié)果Table 3 Result of principal component analysis of physiological-biochem ical indexes of five species in Rhododendron L.under high tem perature stress

通過降維，可把原來6個相互關(guān)聯(lián)的生理生化指標轉(zhuǎn)換成3個新的相互獨立的綜合指標，并保留了原指標的絕大部分信息。對于同一綜合指標而言，數(shù)值越大，說明某一種類在這一綜合指標上的耐熱性越強，反之則越弱。但是，杜鵑不同種類的耐熱性并不是由某一個綜合指標決定的，而是由3個綜合指標共同決定的，而這3個綜合指標的貢獻率不同、所起的作用也不相同，因此應(yīng)進行進一步的綜合評價。

2.2 高溫脅迫條件下5種杜鵑耐熱性的綜合評價及檢驗

2.2.1 耐熱性的綜合評價 根據(jù)主成分表達式及隸屬函數(shù)公式［8-9］分別求得5種杜鵑在不同溫度條件下的各綜合指標值CI(x)及其隸屬函數(shù)值U(x)，詳見表4。對于同一個綜合指標而言，如CI(1)，白花杜鵑在38℃脅迫條件下，其CI(1)值(3.281 7)最大，對應(yīng)的U(1)值(1.000 0)也最大，表明38℃時白花杜鵑的綜合指標CI(1)表現(xiàn)出最強的耐熱性。

根據(jù)貢獻率大小及累計貢獻率(表3)計算出各綜合指標的權(quán)重，分別為0.594 3、0.219 4、0.186 3 (表4)。

表4 高溫脅迫條件下5種杜鵑的綜合指標值CI(x)及其權(quán)重、隸屬函數(shù)值U(x)、綜合評價值D及預測值Table 4 The values of com prehensive index CI(x)and weight，subordinate function value U(x)，comprehensive evaluation value D and prediction value of five species in Rhododendron L.under high temperature stress

根據(jù)各綜合指標的U(x)值和權(quán)重，得出5種杜鵑在不同溫度條件下的耐熱性綜合評價值D(表4)。D值反映了不同種類的綜合耐熱能力大小，D值越大，表明其耐熱能力越強。由表4可見：在38℃條件下，5種杜鵑的D值均最大；30℃條件下D值次之；而在22℃條件下D值最小。在同一溫度條件下，5種杜鵑的綜合耐熱能力排序有一定差異：22℃條件下，5種杜鵑的D值由大到小依次為白花杜鵑、毛棉杜鵑、紅灘杜鵑、羊躑躅、紅棕杜鵑；30℃條件下依次為白花杜鵑、毛棉杜鵑、羊躑躅、紅灘杜鵑、紅棕杜鵑； 38℃條件下則依次為白花杜鵑、羊躑躅、毛棉杜鵑、紅灘杜鵑、紅棕杜鵑。在3個溫度條件下白花杜鵑的D值均最大，表明其耐熱性最強；紅棕杜鵑的D值均最小，表明其耐熱性最弱。毛棉杜鵑D值較大、紅灘杜鵑較小；在22℃條件下羊躑躅D值相對較小，但隨著脅迫溫度的升高其D值排序逐漸上升，說明杜鵑花對高溫脅迫的耐性受到脅迫強度的影響，不同種類、不同脅迫強度下其耐熱機制存在一定差異。

2.2.2 耐熱性綜合評價結(jié)果的檢驗 將不同溫度條件下5種杜鵑的耐熱性綜合評價值(D)作因變量、各指標的標準化值作自變量，采用逐步回歸法建立的最優(yōu)回歸方程為：D=0.471 8+0.031 3X1+0.075 2X2+ 0.066 3X3+0.045 3X4+0.072 4X5+0.029 5X6。式中，X1、X2、X3、X4、X5和X6分別代表MDA、H2O2和Pro含量及SOD、CAT和APX活性的標準化值。6個自變量的偏回歸系數(shù)均達到了極顯著水平，回歸方程的決定系數(shù)R2=0.999 9，表明6個自變量可決定D值總變異的99.99％。用該回歸方程對不同溫度條件下5種杜鵑的耐熱性進行預測，其預測值(表4)與綜合評價值D在各種類及溫度間的大小次序完全一致，兩者高度相關(guān)(r=1)并達到極顯著水平。說明該方程能夠很好地量化各種類的綜合耐熱能力與各指標值間的因果關(guān)系，可用于對杜鵑種間耐熱性進行科學準確的預測。

3 討論和結(jié)論

植物耐熱性不僅與其種類、發(fā)育時期、形態(tài)性狀及代謝活動有關(guān)，且受逆境的發(fā)生時期、持續(xù)時間、脅迫強度和強弱變化以及研究的目的性狀等多種因素的影響，是植物與環(huán)境相互作用的結(jié)果［18，20］。不同植物耐熱機制不同、對某一具體指標的耐熱反應(yīng)也不盡相同，單一指標難以準確、真實地反映植物的耐熱性強弱，多種指標的綜合評價則較為科學準確。但多指標的綜合評價又存在以下問題［7-8，10，21］：各指標間具有一定的相關(guān)性而使信息發(fā)生交叉與重疊，各指標在綜合評價中的重要性(權(quán)重)也不同，因此不能直接利用多指標進行綜合評價。

本研究利用各指標間內(nèi)在的深層次聯(lián)系，采用主成分分析法將原來個數(shù)較多且彼此相關(guān)的指標轉(zhuǎn)換成個數(shù)較少且相互獨立的綜合指標，克服了信息的重疊和指標間的相關(guān)性；并在此基礎(chǔ)上計算出每個物種的綜合指標值及相應(yīng)的隸屬函數(shù)值和權(quán)重，避免了人為確定權(quán)重的主觀性；通過加權(quán)求和法，得到了每一物種在不同溫度條件下的耐熱性綜合評價值，這樣既考慮了各指標間的相互關(guān)系，又考慮了各指標的重要性，從而使獲得的評價結(jié)果更為科學合理。主成分分析結(jié)果表明：6個原始指標可被轉(zhuǎn)換成3個綜合指標，累計貢獻率達87.52％。在貢獻率最大的第1主成分中，CAT和APX活性的特征向量較大，其次是Pro和H2O2含量；而SOD活性和MDA含量的特征向量僅在貢獻率相對較小的第2和第3主成分中較大。生理生化指標的測定結(jié)果表明：高溫脅迫下CAT和APX活性增幅最大，Pro和H2O2含量的增幅也較大，而MDA含量增幅相對較小，SOD活性變化幅度極小。可見，測定的6個生理生化指標對高溫脅迫的誘導響應(yīng)強弱與主成分分析得出的各指標重要性相吻合。據(jù)此推測：高溫脅迫下杜鵑主要通過提高CAT和APX活性及Pro含量來清除活性氧和維持細胞膜滲透性的穩(wěn)定，以減輕高溫脅迫的傷害。

綜合評價值D的分析結(jié)果表明：在同一溫度條件下，供試的5種杜鵑中，白花杜鵑的D值最大，紅棕杜鵑的D值最小，毛棉杜鵑、羊躑躅和紅灘杜鵑的D值介于前兩者之間，但在30℃和38℃條件下毛棉杜鵑和羊躑躅的D值均大于紅灘杜鵑，因此，可將5種杜鵑的耐熱性劃分為4個等級：白花杜鵑的耐熱性最強，其次是毛棉杜鵑和羊躑躅，紅灘杜鵑較弱，紅棕杜鵑最弱，這一結(jié)果與5種杜鵑的田間耐熱性表現(xiàn)［2］相一致。不同溫度條件下5種杜鵑的D值差異較大，均表現(xiàn)為38℃時最大，30℃時居中，22℃時最小，說明5種杜鵑對38℃高溫脅迫的反應(yīng)強烈，可作為不同種類杜鵑耐熱性評價的指示溫度。

周廣生等［22］認為：利用逐步回歸法建立的抗逆性綜合評價值與所測指標間的最優(yōu)回歸方程，可以預測供試對象的抗逆性強弱，使抗逆性鑒定更有預見性。本研究應(yīng)用所建立的最優(yōu)回歸方程對5種杜鵑在不同溫度條件下的綜合耐熱性進行了預測，結(jié)果顯示：預測值與綜合評價值在所有種類及處理間的大小次序完全一致，說明該方法能客觀、準確地評價杜鵑苗期的耐熱性。

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