湖北省水稻條紋葉枯病的發(fā)生與檢測(cè)

摘要：由灰飛虱（Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘ ｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓ）持久傳播的水稻條紋病毒（ＲＳＶ）引起的水稻條紋葉枯病在我國(guó)長(zhǎng)江中下游粳稻種植區(qū)造成嚴(yán)重的損失。２０１１年，在湖北省孝感市一種植粳稻品種嘉優(yōu)２號(hào)的田塊中發(fā)現(xiàn)約１０％的植株呈現(xiàn)典型的水稻條紋葉枯病癥狀，分子檢測(cè)證實(shí)發(fā)病植株病原物為ＲＳＶ，ＰＣＲ產(chǎn)物ＴＡ克隆并測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)了發(fā)病植株病原物為ＲＳＶ。灰飛虱能在湖北省越冬，并能傳播水稻條紋葉枯病，因此，ＲＳＶ對(duì)該區(qū)的粳稻種植存在潛在的威脅，應(yīng)及早采取應(yīng)對(duì)措施。

關(guān)鍵詞：ＲＳＶ；ＲＴ－ＰＣＲ；粳稻；湖北省

中圖分類號(hào)：Ｓ４３５．１１１．４＋９ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ 文章編號(hào)：0439－８114（２０11）24－5101-03

Occurrence and Detection of Rice Stripe Virus in Hubei Province

ＹUAN Ｂｉｎ１，ＺHANG Ｓｈｕ１，Ｌ?譈 Ｌｉａｎｇ１，ＹANG Ｘｉａｏ－ｌｉｎ１，ＣHANG Ｘｉａｎｇ－ｑｉａｎ１，ＬIU Ｈｕａ－ｌｉｎ２，ＹU Ｄａ－ｚｈａｏ１

（１． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｏｉｌ Ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｕｈａｎ ４３００６４；

２． Ｓｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｆ Ｘｉａｏｇａｎ，Xiaogan 432000，Hubei，China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｒｉｃｅ ｓｔｒｉｐｅ ｄｉｓｅａｓｅ， ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｒｉｃｅ ｓｔｒｉｐｅ ｖｉｒｕｓ （ＲＳＶ） ａｎｄ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｍａｌｌ ｂｒｏｗｎ ｐｌａｎｔ ｈｏｐｐｅｒ （Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘ ｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓ）， ｈａｓ ｃａｕｓｅｄ ｓｅｒｉｏｕｓ ｙｉｅｌｄ ｌｏｓｓ ｏｆ jａｐｏｎｉｃａ rｉｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｄｄｌｅ ａｎｄ ｌｏｗｅｒ ｒｅａｃｈｅｓ ｏｆ Ｙａｎｇｔｚｅ Ｒｉｖｅｒ． Ｉｎ ２０１１， １０％ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ infected by ｒｉｃｅ ｓｔｒｉｐｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ａ ｒｉｃｅ ｆｉｅｌｄ ｔｈａｔ ｐｌａｎｔｅｄ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｊｉａｙｏｕ２ ｉｎ Ｘｉａｏｇａｎ， Ｈｕｂｅｉ ｐｒｏｖｉｎｃｅ． ＲＴ－ＰＣＲ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ， ａｎｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ， ｃｏｎｆｉｒｍｉｎｇ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｗａｓ ｉｎｄｅｅｄ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ＲＳＶ． Ｉｔ ｈａｓ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ ｒｉｃｅ ｓｔｒｉｐｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｈｕｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ＲＳＶ ｉｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｒｅａｔ ｆｏｒ ｊａｐｏｎｉｃａ ｒｉｃｅ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｉｓ ａｒｅａ， ａｎｄ ｉｔ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｔｏ ａｄｏｐｔ ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ ｍｅａｓｕｒｅｓ ｔｉｍｅｌｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄs： ＲＳＶ； ＲＴ－ＰＣＲ； jａｐｏｎｉｃａ rice； Hubei province

２０１１年，在湖北省孝感市一塊處于分蘗初期的粳稻品種嘉優(yōu)２號(hào)田發(fā)現(xiàn)約１０％的植株生長(zhǎng)不正常，有的植株部分葉片呈黃綠色，有的植株心葉有黃綠色條斑，有的條斑從基部沿葉脈向葉尖蔓延，有的條斑向下蔓延到葉鞘，有的植株心葉呈黃色枯萎卷曲下垂形成枯心，部分植株已經(jīng)枯死，呈現(xiàn)典型的水稻條紋葉枯病癥狀。推測(cè)可能是由ＲＳＶ（Ｒｉｃｅ sｔｒｉｐｅ vｉｒｕｓ）引起的病毒病——水稻條紋葉枯病。該病毒病在水稻全生育期均可以發(fā)生，是水稻的一種毀滅性病害，迄今尚未見湖北省水稻條紋葉枯病發(fā)生的相關(guān)報(bào)道。

水稻條紋葉枯病病原屬纖細(xì)病毒屬（Ｔｅｎｕｉｖｉｒｕｓ），該屬病毒具有獨(dú)特的基因組結(jié)構(gòu)，病毒粒體由４種ｓｓＲＮＡ和單一外殼蛋白組成。ＲＳＶ只侵染禾本科植物，由灰飛虱（Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘ Ｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓ）以持久性方式傳播，可以在昆蟲體內(nèi)增殖，能經(jīng)卵傳給后代［１］。為確定病田發(fā)生的病害是否由ＲＳＶ引起，從田間取樣帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分子檢測(cè)。

１ 材料與方法

１．１ 試驗(yàn)材料

在發(fā)病稻田取具備典型水稻條紋葉枯病癥狀的病株１２株和無癥植株２株作為樣品，進(jìn)行病原物分子檢測(cè)。

１．２ 試驗(yàn)方法

１．２．１ 總ＲＮＡ的提取 采用Ｔｒｉｚｏｌ法提取ＲＮＡ，參照操作手冊(cè)進(jìn)行。各取葉片約２５０ ｍｇ，置于１．５ ｍＬ離心管中，離心管浸入液氮中冷卻，用預(yù)冷的研棒在離心管中研磨，直至樣品變成粉末；加入１ ｍＬ Ｔｒｉｚｏｌ，劇烈搖勻，室溫放置５ ｍｉｎ，使其充分裂解；１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ 離心５ ｍｉｎ，棄沉淀；加入２００ μＬ氯仿，振蕩混勻后室溫放置１５ ｍｉｎ；１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ ４ ℃離心１５ ｍｉｎ，吸取上層水相至新離心管中；加０．５ ｍＬ異丙醇混勻，室溫放置５～１０ ｍｉｎ；１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ ４ ℃離心１０ ｍｉｎ，棄上清液，ＲＮＡ沉于管底；加１ ｍＬ ７５％乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀；８ ０００ ｒ／ｍｉｎ ４ ℃離心５ ｍｉｎ，棄上清液；在超凈工作臺(tái)上吹干５～１０ ｍｉｎ；用ＤＥＰＣ處理并用高壓滅菌的５０ μＬ ｄｄＨ２Ｏ ５５～６０ ℃ ５～１０ ｍｉｎ溶解ＲＮＡ樣品。抽提的ＲＮＡ置于－２０ ℃冰箱備用。

１．２．２ ＲＳＶ 病毒的ＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè) 利用嵇朝球等［２］設(shè)計(jì)的特異檢測(cè)ＲＳＶ的兩對(duì)引物Ｃ１：５′ ＣＧＣＴＣＧＡＧＧＴＴＣＡＧＴＣＴＡＧＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣ ３′，Ｃ２：５′ ＣＧＡＧＡＴＣＴＴＡＧＡＡＴＧＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡＧＣＣ ３′和Ｓ１：５′ ＣＧＣＴＣＧＡＧＡＧＡＡＴＣＧＡＡＧＡＴＧＣＡＡＧＡＧ

ＧＴＡ ３′，Ｓ２：５′ ＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＴＡＴＧＴＥＴＴＧＴＧＴＡＧ

ＡＡＧＡＧＧ ３′進(jìn)行分子檢測(cè)，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。采用兩步ＲＴ－ＰＣＲ進(jìn)行鑒定。測(cè)定抽提的ＲＮＡ濃度，依據(jù)各樣品的濃度取１ μｇ ＲＮＡ置于０．５ ｍＬ的離心管中；加入１ μＬ １０×反應(yīng)緩沖液和１ μＬ ＤＮＡａｓｅ，補(bǔ)ｄｄＨ２Ｏ到１０ μＬ，３７ ℃處理１５ ｍｉｎ，６５ ℃滅活１０ ｍｉｎ，置于冰上５ ｍｉｎ；加１ μＬ １０ μｍｏｌ／μＬ ９ ｂｐ隨機(jī)引物，６５ ℃變性１０ ｍｉｎ，置于冰上５ ｍｉｎ；加入反轉(zhuǎn)錄酶、ｄＮＴＰ等混合液，３７ ℃水浴４５～６０ ｍｉｎ，６５ ℃滅活１０ ｍｉｎ。取１ μＬ反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，反應(yīng)程序依照嵇朝球等［２］的方法進(jìn)行，瓊脂糖凝膠電泳，ＥＢ染色后照相。

１．２．３ ＲＴ－ＰＣＲ產(chǎn)物的克隆和序列比較 利用生工生物工程（上海）有限公司生產(chǎn)的回收試劑盒回收ＣＰ和ＳＰ的擴(kuò)增產(chǎn)物，以Ｐｒｏｍｅｇａ公司的ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ系統(tǒng)ＴＡ克隆目的片段，挑陽(yáng)性克隆抽質(zhì)粒ＡＢＩ ３７３０測(cè)序。

２ 結(jié)果與分析

２．１ 病株的病原物檢測(cè)

利用Ｔｒｉｚｏｌ法抽提發(fā)病田１４個(gè)植株樣品和１個(gè)健康樣品（取自武漢試驗(yàn)田）的ＲＮＡ，采用ＲＴ－ＰＣＲ方法分別檢測(cè)ＲＳＶ的ＣＰ和ＳＰ基因。發(fā)病田塊１４個(gè)樣品均擴(kuò)增出位于１ ０００ ｂｐ附近的ＣＰ基因目的帶，同時(shí)也檢測(cè)到位于５００ ｂｐ上部的ＳＰ基因目的帶（圖１），而健康樣品和ｄｄＨ２Ｏ中沒有擴(kuò)增出任何產(chǎn)物。這個(gè)結(jié)果表明孝感市發(fā)病田發(fā)生的病害是由ＲＳＶ引起的。值得注意的是，孝感市發(fā)病田的２株無癥植株也檢測(cè)到目的帶，但比有明顯癥狀的病株目的帶要弱，可能是由于植株體內(nèi)病毒含量低以至于癥狀不明顯。這顯示發(fā)病田實(shí)際的ＲＳＶ感染狀況比田間觀察到的要嚴(yán)重。

２．２ ＲＳＶ基因組部分序列比對(duì)

將上述ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物分別ＴＡ克隆并測(cè)序（圖２）。用獲得的序列分別在ＮＣＢＩ中做ＢＬＡＳＴ，獲得的ＣＰ序列檢索結(jié)果表明其與已發(fā)表的ＲＳＶ Ｒ３序列（登錄號(hào)ＦＪ６０２６８６）有９９％的序列同源性；獲得的ＳＰ序列檢索結(jié)果表明其與已發(fā)表的ＲＳＶ Ｒ４序列（登錄號(hào)ＥＵ９３１５１３）同樣有９９％的序列同源性。測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)孝感市發(fā)病田發(fā)生的水稻病害確實(shí)是由ＲＳＶ引起。

３ 討論

根據(jù)田間癥狀及病原物分子檢測(cè)，確認(rèn)孝感市粳稻種植田塊發(fā)生的病害為水稻條紋葉枯病，該病目前在湖北省發(fā)生面積較小。該病毒危害的特點(diǎn)是：有著廣泛的寄主，能夠侵染小麥、大麥、玉米等８０多種禾本科植物［３］，其中對(duì)水稻的危害最為嚴(yán)重，發(fā)病嚴(yán)重的田塊病株率高達(dá)５０％，產(chǎn)量損失２０％～３０％，嚴(yán)重的甚至絕收；一般水稻條紋葉枯病的發(fā)生直播田重于移栽田、早栽田重于遲栽田、人工移栽田重于機(jī)插秧田、土質(zhì)差的田塊重于土質(zhì)好的田塊；粳稻發(fā)生較重，秈稻較少發(fā)生［４］。傳播ＲＳＶ的灰飛虱能夠在本地越冬導(dǎo)致該病成為常駐病害，以至于發(fā)生范圍逐步擴(kuò)大，發(fā)生程度逐年加重。

３．１ ＲＳＶ對(duì)湖北省水稻生產(chǎn)的潛在威脅

水稻是湖北省種植面積最大、總產(chǎn)最高的農(nóng)作物，占糧食總播種面積的５０％以上、總產(chǎn)７０％左右、商品量８０％［５］。近年來，隨著人們生活水平的提高，對(duì)大米品質(zhì)要求也隨之提高，特別是優(yōu)質(zhì)粳米越來越受到人們歡迎。湖北省于１９９９年推出了發(fā)展優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)業(yè)“四優(yōu)”工程，其中首要的就是發(fā)展優(yōu)質(zhì)稻米［６］， 而擴(kuò)大優(yōu)質(zhì)粳稻種植面積是提高米質(zhì)的重要途徑之一。２０世紀(jì)９０年代，水稻條紋葉枯病在江蘇發(fā)生并暴發(fā)成災(zāi)，蔓延至整個(gè)長(zhǎng)江中下游稻區(qū)，僅２００４年江蘇省有４２個(gè)縣發(fā)生水稻條紋葉枯病，面積達(dá)１５７萬ｈｍ２，占水稻總栽培面積的７９％，絕收面積達(dá)５ ２００ ｈｍ２，成為水稻生產(chǎn)上最主要的病害之一［７］。

根據(jù)糧食區(qū)域規(guī)劃，湖北省在江漢平原、鄂東北、鄂北等水稻主產(chǎn)區(qū)推廣優(yōu)質(zhì)晚粳新品種，擴(kuò)大粳稻種植面積幫助農(nóng)民增收。分析表明ＲＳＶ對(duì)湖北省粳稻種植存在潛在的威脅：①湖北省粳稻未進(jìn)行抗ＲＳＶ育種，推廣品種也未做抗ＲＳＶ鑒定。這次孝感市發(fā)生ＲＳＶ田塊種植粳稻品種是浙江育成的嘉優(yōu)２號(hào)，田間調(diào)查有約１０％的植株發(fā)病，ＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)結(jié)果顯示無癥植株也帶有ＲＳＶ。研究顯示大部分粳稻品種對(duì)ＲＳＶ感病，秈稻基本對(duì)ＲＳＶ抗病［７］。長(zhǎng)期以來，湖北省以秈稻種植為主，粳稻種植面積不大，隨著粳稻種植面積的擴(kuò)大，ＲＳＶ可能成為湖北省水稻種植的威脅。近年來，與湖北交界的河南多次發(fā)生嚴(yán)重的ＲＳＶ危害也說明了這一點(diǎn)［８］。②與遷飛進(jìn)入湖北的褐飛虱和白背飛虱不同，作為ＲＳＶ的持久傳播介體灰飛虱能在本地越冬，在湖北省可以發(fā)生５～６代，４月中旬就進(jìn)入早稻秧田為害［９］。鑒于ＲＳＶ不能通過種質(zhì)傳播，所以孝感發(fā)生的ＲＳＶ是由本地灰飛虱帶毒傳播的。值得注意的是，發(fā)病田塊以及周邊田塊灰飛虱的數(shù)量極少，推測(cè)本田的病株是從秧田帶入，表明ＲＳＶ在當(dāng)?shù)匾呀?jīng)成為常駐病害。③地處華中的湖北省是小麥、玉米和水稻混栽區(qū)，而這三者都是ＲＳＶ的寄主，種植期和生育期各不相同有利于ＲＳＶ的傳播。小麥?zhǔn)嵌鹤魑铮c水稻種植季節(jié)銜接，易成為ＲＳＶ的越冬寄主，所以ＲＳＶ一旦在湖北流行將造成小麥、玉米和水稻的嚴(yán)重?fù)p失。

３．２ 應(yīng)對(duì)ＲＳＶ病害威脅的措施

針對(duì)ＲＳＶ對(duì)湖北粳稻種植潛在的威脅，建議加強(qiáng)ＲＳＶ在湖北的流行病學(xué)研究，調(diào)查灰飛虱在湖北的分布、發(fā)生情況、當(dāng)前氣候下以及當(dāng)前耕作制度下的消長(zhǎng)關(guān)系，并檢測(cè)其帶毒率。當(dāng)前應(yīng)采取以下措施提前預(yù)防水稻條紋葉枯病的發(fā)生：①對(duì)湖北省內(nèi)推廣的粳稻品種進(jìn)行抗ＲＳＶ鑒定，明確哪些品種是抗病品種，哪些品種是感病品種，為品種合理布局提供依據(jù)。②加強(qiáng)省內(nèi)粳稻抗ＲＳＶ育種工作，使得新推出的品種具有抗ＲＳＶ的能力。③充分利用分子生物學(xué)技術(shù)創(chuàng)建抗ＲＳＶ新種質(zhì)［１０］。

目前生產(chǎn)上采取措施進(jìn)行綜合防治是必需的：①稻田的合理布局，在小麥－水稻輪作區(qū)，水稻秧田要遠(yuǎn)離小麥地，避免灰飛虱從小麥上傳播ＲＳＶ到秧田。②避免將不同生育期的水稻種植在一起，形成“插花”。③近年來，江蘇等地育成了一批抗ＲＳＶ的粳稻品種，適當(dāng)引進(jìn)適合湖北省種植的品種以限制ＲＳＶ的蔓延。④做好灰飛虱的防治工作。

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