除草劑室內高通量篩選方法研究

摘要：以狗牙根為材料，對除草劑篩選的限制因素進行了研究。結果表明，水分流失和真菌污染是引起篩選結果不穩定的主要因素；運用多種規格的組織培養板和霧化補水可以控制水分流失對篩選的不利影響；添加抗真菌劑和對種子進行殺菌處理可以消除真菌污染對靶標的侵害和延長試驗的可觀察時間。進一步的篩選試驗結果表明，運用以上方法能夠穩定、高效地對不同來源的樣品進行篩選。

關鍵詞：高通量篩選；除草活性；種子處理；抗真菌劑

中圖分類號：Ｓ４８２．４ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）24－5119-03

Study on High Throughput Screening of Herbicide

ＺＨＡＮＧ Ｚｈｉ－ｇａｎｇ，ＹＡＮＧ Ｚｉ－ｗｅｎ，ＷＡＮＧ Ｋａｉ－ｍｅｉ，ＺＨＡＮＧ Ｙａ－ｎｉ，ＺＨＡＮＧ Ｚｕｎ－ｘｉａ

（Ｈｕｂｅｉ Ｂｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ／Ｔｈｅ Ｂｒａｎｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅ， Ｈｕｂｅｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｗｕｈａｎ ４３００６４，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ， ｖａｒｉｏｕｓ ｆａｃｔｏｒｓ ｔｈａｔ ａｆｆｅｃｔ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｇｒａｓｓ ｉｎ ｔｅｓｔｉｎｇ ｐｌａｔｅｓ were studied． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｋｅｙ ｆａｃｔｏｒｓ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｌｏｓｓ ｏｆ ｗａｔｅｒ ａｎｄ ｆｕｎｇａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｓｏ ａ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍｏｄｅｌ was advanced ｔｏ ｂｒｅａｋ ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ． Ｔｈｅ ｌｏｓｓ ｏｆ ｗａｔｅｒ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅｓｔｉｎｇ ｐｌａｔｅｓ ａｎｄ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｗａｔｅｒ ｂｙ ｔｈｅ ａｔｏｍｉｚｅｒ； ｂｙ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｆｕｎｇｉｃｉｄｅ ａｎｄ ｓｅｅｄｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ， ｔｈｅ ｐｒｏｂｌｅｍ ｏｆ ｆｕｎｇａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｓｏｌｖｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｅｒｉｏｄ ｏｆ ｔｅｓｔｉｎｇ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｌｅｎｇｔｈｅｎｅｄ． Ｔｈｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｔｅｓｔｅｄ ａｎｄ ｖｅｒｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｒｅｅ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ ａｂｏｕｔ １２８０ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｕｒｃｅｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｉｔ ｉｓ ａ ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｕｒｃｅｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： hｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ； hｅｒｂｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ； sｅｅｄｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ； fｕｎｇｉｃｉｄｅ．

直接應用目標雜草進行除草劑篩選具有針對性強、活性反應真實、直觀等優點，在新藥發現方面更具有獨特的優勢。而對于來源多樣、理化性質復雜及數量巨大的樣品，直接使用目標雜草進行篩選存在著操作復雜、工作量大、活性重現性差、可觀察時間短等諸多瓶頸。本試驗以狗牙根種子為篩選起點，使用瓊脂為載體對除草劑室內高通量篩選的限制因素進行了探索［１］，同時選擇３個標準樣品和一些不同來源的樣品進行了篩選，旨在找到高效、穩定的除草劑室內高通量篩選方案。

１ 材料與方法

１．１ 試驗材料

１．１．１ 種子 狗牙根種子發芽率大于７０％，保藏溫度為１７～２０ ℃。

１．１．２ 培養基原料 瓊脂粉（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，型號ＤＨ０１０－４）、ＰＤＢ培養基原料（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ CO.）。

１．１．３ 試劑及標準樣品 試劑丙酮、乙醇、二甲基亞砜、吐溫－８０均為市售分析純，抗菌劑特比萘芬、放線菌酮、嘧菌酯、咪鮮胺為市售分析純，除草劑標準樣品乙草胺、草甘膦、硝磺酮為市售原藥。

１．１．４ 供篩選試驗樣品 化學合成物由湖北省生物農藥工程研究中心綠色化學研究室提供，真菌和放線菌發酵提取物由湖北省生物農藥工程研究中心微生物工程研究室提供，微生物源先導化合物及植物提取物由湖北省生物農藥工程研究中心先導化合物分析室提供。

１．１．５ 主要儀器、設備 Ｂ１００－１Ｆ蠕動泵、ＫＱ－２５０ＤＥ型數控超聲波清洗器、醫用霧化器、ＢＩＯＨＩＴ ｅＬＩＮＥ（ＭＣＥ８ｋ）電子移液器、Ｈｉｇｈ Ｔｅｃｈ Ｌａｂ ＤＶ８－２００移液器、人工氣候室（光、溫、濕可調）、經過滅菌處理的９６孔組織培養板和深孔組織培養板、ＪＮ．ＧＬ １００ Ｗ ＬＥＤ植物生長燈（０．４ ｍ距離光照度為３ ５００～４０００ ｌｘ）、生物安全柜。

１．２ 試驗方法

１．２．１ 狗牙根生長試驗 試驗設４個處理組：第一組為載體對照組，把０．７％的瓊脂加入９６孔組織培養板，每孔加入量為０．２ ｍＬ；第二組為種子對照組，在作為載體的瓊脂表面接入未經處理的狗牙根種子，接入量約為２０粒／孔；第三組為種子殺菌處理組，在瓊脂表面接入經過殺菌處理的種子，接入量約為２０粒／孔；第四組為加入營養成分的載體對照組，把真菌培養基（已加入抗細菌劑重鉻酸鉀，終濃度為０．０２０ ｍｇ／ｍＬ）加入９６孔組織培養板。組織培養板移入７０ ｃｍ × ４０ ｃｍ × １５ ｃｍ的無蓋白色食品盆中，盆口以透明塑料薄膜覆蓋。所有培養盆均在人工氣候室中培養（３０ ℃、相對濕度７０％～８０％、光照１４ ｈ／ｄ，光源１００ Ｗ ＬＥＤ植物生長燈距植物２０～２５ cm）。每個處理組使用３個組織培養板，每組設２個重復。每天稱取培養板重量，并計算各組水分流失的平均值。同時觀測４、７、１４ ｄ時植物生長狀況及真菌污染情況。

１．２．２ 培養板中真菌的分離及抑菌試驗 從１．２．１生長試驗中培養１４ ｄ后的組織培養板中分離真菌，并進行純化培養［２］，使用管碟法半定量測定特比萘芬、放線菌酮、嘧菌酯、咪鮮胺對分離獲得的３個真菌純培養的抑菌效果［３］，根據抑菌圈的大小進行抑菌活性分級。各抗真菌劑使用３個濃度梯度（０．０２０、０．０１０、０．００２ ｍｇ／ｍＬ）進行試驗。

１．２．３ 抗菌劑及種子處理的應用效果試驗 根據１．２．２的結果，選擇抑菌活性最強和最弱的抗菌劑。試驗中使用的狗牙根種子分為２組，一組為未處理的普通種子，另一組以溫湯法進行殺菌處理［４］。

１．２．４ 穩定性試驗

１）活性評價指標。根據活性反應的不同，使用２項指標標記除草活性。一是以株高為指標進行標記，按０、３、５、７、９分級。０表示無活性，指標為株高與陰性對照組株高一致； ９表示活性為１００％，指標為種子未萌發。在０與９之間設置３個級別，對于植株株高明顯高于陰性對照的樣品標記為“Ｓ”。二是以植株黃化程度為指標進行標記，按０、３Ｙ、５Ｙ、７Ｙ、９Ｙ分級，０表示無活性，指標為植株黃化程度與陰性對照組一致，所有植株均發生黃化標記為“９Ｙ”，在０與９Ｙ之間設置３個級別。

２）標準樣品穩定性篩選試驗。作為植物生長載體的瓊脂（０．７％）中加入嘧菌酯，終濃度為０．００２ ｍｇ／ｍＬ。種子經過滅菌處理。３個標準樣品母液濃度為１．００ ｍｇ／ｍＬ，以無菌水稀釋成１２個濃度。９６孔組織培養板中瓊脂表面涂布樣品溶液量為０．０１ ｍＬ／孔，每個濃度設２個重復。試驗重復５次。培養條件為溫度３０ ℃、相對濕度７０％～８０％，光照時間１０ ｈ／ｄ，光源為１００ Ｗ ＬＥＤ植物生長燈距植物２５～３０ cm。

３）不同來源樣品的篩選試驗。隨機選擇不同來源的樣品１ ２８０個，其中包括化學合成物６４個、微生物發酵提取物１０５６個、微生物源先導化合物６４個及植物提取物９６個。將以無菌水稀釋后的樣品溶液涂布到瓊脂表面，樣品濃度為１．００ ｍｇ／ｍＬ，涂布量為０．０１ ｍＬ／孔，然后接入狗牙根種子［５］。以無菌水為空白對照。每個處理設３個重復。瓊脂、種子滅菌處理及培養條件同上。

２ 結果與分析

２．１ 種子在瓊脂上的生長試驗

２．１．１ 培養板水分流失試驗 培養板水分流失不僅影響植物的正常生長和試驗的可觀察時間，而且會引起樣品濃度的變化。在培養９ ｄ后，水分流失５０％左右；接入了種子的培養板較未接入種子的培養板中水分流失更多。

２．１．２ 真菌污染試驗 以目測法對瓊脂表面真菌生長情況及植物生長情況進行觀測。結果（表１）顯示，引起培養板中真菌污染的真菌來源于種子和培養環境；并且種子為真菌生長的營養來源；真菌菌絲的密集生長引起培養孔中的植株發生黃化，即造成假陽性結果；假陽性率與真菌感染率正相關。

２．２ 真菌的分離及抑菌試驗

從１．２．１試驗中培養１４ ｄ的組織培養板中分離得到３種真菌純培養物，初步鑒定為根霉、曲霉和蠕孢霉。應用管碟法測定抑菌效果的結果（表２）顯示，嘧菌酯對３種真菌抑制效果最好，咪鮮胺效果最差，其他２種抗菌劑抑菌活性居中。

２．３ 抗真菌劑及種子處理的應用效果試驗

抑菌試驗結果見表３，種子殺菌處理和抗真菌劑對控制真菌污染都有明顯的作用；嘧菌酯表現出良好的抑菌能力，而咪鮮胺的抑菌效果差，該結果與管碟法所測定的抑菌活性結果一致。

２．４ 穩定性試驗

２．４．１ 標準樣品穩定性試驗 對３個不同類型的標準樣品進行穩定性試驗，培養７ ｄ后按目測分級法，根據株高及植株黃化程度進行分級。從表４可以看出，標準樣品穩定性試驗中５次重復的變異系數（CV）均在3０％以下。作為以快速定性為目標的除草劑室內高通量篩選方法，這一指標已經達到要求。

２．４．２ 不同來源樣品的篩選試驗結果 篩選試驗中所有培養板中均無真菌浸染，各重復活性反應一致；１ ０５６個微生物發酵提取物中檢出活性樣品９個；６４個微生物源先導化合物中檢出活性樣品１個；６４個化學合成物和９６個植物提取物中均無活性樣品檢出。

３ 討論

與濾紙平皿法、盆栽法等篩選方法比較，使用瓊脂平板作為載體的篩選方法具有可自動化程度高、可觀察時間長、樣品消耗少、篩選通量大等優點。在水分流失和真菌污染對靶標的影響得到控制后，篩選結果穩定。本試驗中選用的狗牙根種子較小，其生物量增長慢，僅通過提高水分總量（如使用深孔板或孔徑較大的培養板等）就可以達到延長可觀察時間的目的。對于子粒較大的種子，因其生物量增長速度快，水分消耗速度也較快，則需要補水。在除草劑篩選過程中，作為篩選靶標的植物種子為真菌的生長提供了充足的營養，因此真菌在培養板中生長迅速；而且在高濕、弱光照的小環境中，快速滋生的真菌會嚴重影響種子的正常萌發和植株的正常生長，進而影響篩選結果的準確性，因此抗菌劑的使用成為必要。隨著現代農用抗菌劑的發展，可供選擇的抗真菌劑越來越多，抗菌劑對除草劑活性存在的協同或頡頏影響尚待進一步研究。

參考文獻：

［１］ 逄 森，袁會珠，李保同，等．利用９６孔板建立除草劑微量活體篩選方法初探［Ｊ］．農藥學學報，２００５，７（４）：３３４－３３８．

［２］ 梁 晨，呂國忠． 土壤真菌分離和計數方法的探討［Ｊ］． 沈陽農業大學學報，２０００，３１（５）： ５１５－５１８．

［３］ 李 凡，朱志華，姜鳳麗，等． 管碟法測定生物效價影響因素的探討及改進［Ｊ］． 中國獸藥雜志，２００８（１）：４５－４８．

［４］ 張志元，羅永蘭，官春云．油菜種子內生菌的檢測及殺菌消毒處理方法［Ｊ］．湖北農業科學，２００５（１）：５２－５５．

［５］ 許勇華，臺方俊，陳 杰． 新農藥創制中除草活性評價程序及方法概述［Ｊ］． 現代農藥，２００９（５）：１７－２０．