甘薯與根腐病相關AFLP標記篩選

摘要：甘薯根腐病是由甘薯根腐病病原菌［Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ（Ｍａｒｔ．）Ｓａｃｃ． ｆ． ｓｐ． ｂａｔａｔａｓ ＭｃＣｌｕｒｅ，簡稱ＦＳＢ］引起的一種真菌性毀滅性病害，傳播途徑廣，蔓延速度快，近年有向長江流域以南地區(qū)傳播的趨勢，對甘薯生產(chǎn)造成極大危害。在已有的徐薯１８與勝利百號Ｆ１分離群體抗性鑒定的基礎上，采用分離群體混合分析法（Bｕｌｋｅｄ sｅｇｒｅｇａｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ，ＢＳＡ）與AFLP技術相結合，通過篩選８０對引物，定位與甘薯根腐病相關的分子標記，在感病群體中定位到一個顯性標記，即標記Ｅｃｏ（４５）－Ｍｓｅ（４５）被發(fā)現(xiàn)與感病基因連鎖。所獲試驗結果對甘薯抗病遺傳改良具有指導意義。

關鍵詞：甘薯根腐病；ＡＦＬＰ標記；分離群體混合分析法

中圖分類號：Ｓ５３１；Ｑ３４３．１＋７ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）24－5254-02

Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＦＬＰ Ｍａｒｋｅｒｓ Ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ Ａ Ｌｏｃｕｓ Ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｉｄｅｎｃｅ ｔｏ Ｒｏｏｔ Ｒｏｔ ｉｎ Ｓｗｅｅｔｐｏｔａｔｏ

ＳＵ Ｗｅｎ－ｊｉｎ１，ＷＡＮＧ ｌｉａｎ－ｊｕｎ１，ＬＥＩ Ｊｉａｎ１，ＺＨＡＯ Ｔｉａｎ－ｙａｏ２，ＳＨＵＡＩ Ｑｉｕ－ｊü２，ＹＡＮＧ Ｘｉｎ－ｓｕｎ１

（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｃｒｏｐｓ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｗｕｈａｎ ４３００６４， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｒｏｏｔ ｒｏｔ ｏｆ ｓｗｅｅｔｐｏｔａｔｏ ｉｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ＦＳＢ，ｉｔ ｈａｓ ｍａｎｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗａｙｓ，ａｎｄ ｔｈｅ ｓｐｅｅｄ ｉｓ ｉｎｃｒｅｄｉｂｌｅ，ｉｔ ｂｒｉｎｇｓ ａ ｈｕｇｅ ｈａｒｍ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｄｕｓｔｒｙ ｏｆ ｓｗｅｅｔｐｏｔａｔｏ．Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ，ｔｈｅ Ｆｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｒｏｓｓ ｏｆ ‘Ｘｓｕｓｈｕ １８’ａｎｄ ‘Ｓｈｅｎｇｌｉ １００’ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｆｏｒ ｉｔｓ ｒｏｏｔ ｒｏｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｓｗｅｅｔｐｏｔａｔｏｒ ｔｏ ｒｏｏｔ ｒｏｔ ｗａｓ ｐｒｏｖｅｄ ｔｏ ｂｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ ａ ｇｅｎｅ ｉｎ ａ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｍａｎｎｅｒ．Ｂｕｌｋｅｄ ｓｅｇｒｅｇａｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＳＡ）ｗａｓ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ８０ ＡＦＬＰ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ． Ａ ｍａｒｋｅｒ ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ ａｓ Ｅｃｏ（４５）－Ｍｓｅ（４５） ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｏ ｂｅｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｌｏｃｕｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｓｗｅｅｔｐｏｔａｔｏ ｒｏｏｔ ｒｏｔ； ＡＦＬＰ ｍａｒｋｅｒ； BSA

甘薯是世界上重要的糧食、飼料、工業(yè)原料及新型能源作物，我國是世界上最大的甘薯生產(chǎn)國家，甘薯年種植面積為３８６萬ｈｍ２，鮮薯總產(chǎn)量８ １２１萬ｔ。甘薯以其單位面積生物能產(chǎn)量高，且具有抗旱、耐瘠薄、適應性廣、塊根淀粉含量高等特性，是我國重要的淀粉類能源作物，在國家糧食安全、能源安全、生態(tài)安全、健康安全和農(nóng)民增收等方面起著重要作用［１］。目前甘薯根腐病作為一種真菌性病害已經(jīng)成為制約我國甘薯生產(chǎn)的三大嚴重病害之一，一般發(fā)病地塊減產(chǎn)１０％~２０％，重病地塊植株成片死亡甚至絕產(chǎn)。為控制甘薯根腐病的危害，提高甘薯種植效益，就甘薯根腐病進行分析研究十分必要［２］。

甘薯根腐病至今尚無有效的防治藥劑，目前生產(chǎn)上對該病的防治主要以化學藥劑防治為主，易引起農(nóng)藥殘毒和環(huán)境污染，而且真菌能產(chǎn)生耐藥性。不同的甘薯品種對甘薯根腐病的抗性有顯著差異，選用甘薯抗病品種是防止甘薯根腐病發(fā)生和減輕病害的最經(jīng)濟有效的方法，相關研究表明甘薯根腐病抗性主要以基因加性效應控制，Ｆ１代抗病能力變異廣，病情指數(shù)呈連續(xù)性變異。甘薯對根腐病的抗性是穩(wěn)定的，同一條件下，不同年份變化不大［３］。不同抗病類型的親本進行組合，Ｆ１可出現(xiàn)抗性不同的材料，其中高抗、抗、感、高感類型都有。總的趨勢表現(xiàn)為雙親抗性水平越高的組合，其后代中出現(xiàn)高抗或抗病型的比例就越高［２］。

研究將ＡＦＬＰ技術與分離群體混合分析法（Bｕｌｋｅｄ ｓｅｇｒｅｇａｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ，ＢＳＡ）相結合，通過篩選８０對引物，獲得了一個與甘薯根腐病基因位點連鎖的ＡＦＬＰ標記［４］，所獲試驗結果對甘薯抗病遺傳改良具有指導意義。

１ 材料與方法

１．１ 材料

以高抗甘薯根腐病品種徐薯１８為抗病親本，高感甘薯根腐病品種勝利百號為感病親本，以二者雜交的植株Ｆ１代為試驗材料。

１．２ 方法

１．２．１ 甘薯根腐病接種與抗性鑒定 甘薯根腐病接種與抗性鑒定均由徐州甘薯研究中心完成，供試材料也由該中心提供，２００６年與２００７年兩年完成甘薯根腐病抗性鑒定，分別鑒定甘薯地上與地下兩部分病情指數(shù)，抗性標準劃分：高抗平均病情指數(shù)小于２０．０，抗病平均病情指數(shù)為２０．１～４０．０，中抗平均病情指數(shù)為４０．１～６０．０，感病平均病情指數(shù)為６０．１～８０．０，高感平均病情指數(shù)大于８０．１。

１．２．２ ＤＮＡ提取與抗感基因池建立 每單株選取幼嫩葉片采用改良ＣＴＡＢ法進行ＤＮＡ提取，ＤＮＡ質(zhì)量采用紫外分光光度計和１％瓊脂糖凝膠電泳雙檢測。將符合要求的ＤＮＡ樣品稀釋成濃度為１００ ｎｇ／μＬ待用。

隨機選取３株高感病單株ＤＮＡ等量混合構建感病池，３株高抗病單株ＤＮＡ等量混合構建抗病池。

１．２．３ ＡＦＬＰ-PCR擴增反應及標記分析 ＡＦＬＰ分析采用ＥｃｏＲＩ和Ｍｓｅ Ｉ內(nèi)切酶對甘薯基因組ＤＮＡ酶切，用ＥｃｏＲＩ－ｐｒｅ１、ＭｓｅＩ－ｐｒｅ１，ＥｃｏＲＩ－ｐｒｅ２、ＭｓｅＩ－ｐｒｅ２，ＥｃｏＲＩ－ｐｒｅ３、ＭｓｅＩ－ｐｒｅ３，ＥｃｏＲＩ－ｐｒｅ４、ＭｓｅＩ－ｐｒｅ４ ４對選擇性堿基的引物進行預擴增，預擴增引物稀釋１０倍以后進行選擇性擴增，選用Ｅ、Ｍ引物隨機組合８０對，將擴增產(chǎn)物０．８ Ｌ上樣于６．５％ 聚丙烯酰胺凝膠上進行變性電泳。

２ 結果與分析

２．１ 相關樣品ＤＮＡ檢測及ＡＦＬＰ多態(tài)性引物組合的篩選

ＤＮＡ樣品結果如圖１所示。用８０對引物在抗病和感病基因池之間進行多態(tài)性篩選，有２５對引物能產(chǎn)生多態(tài)性，選取其中表現(xiàn)最好的８對引物進行標記篩選。

２．2 ＡＦＬＰ標記與甘薯根腐病連鎖分析

８對引物在親本與抗病、感病單株上進行標記篩選，其中４對引物在親本與抗病、感病單株上擴增出多態(tài)性條帶，在標記連鎖性方面，標記Ｅｃｏ（４５）－ Ｍｓｅ（４５）在感病親本和３個感病單株上均出現(xiàn)特異條帶，而在抗性親本和3個抗病單株上未出現(xiàn)抗性條帶。因此判定該標記與感病基因連鎖。

３ 討論

選擇性基因型分析（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）最早由Ｌｅｂｏｗｉｔｚ等［５］提出，是增強信號的一種方法，其主要是在一個群體中選擇高、低兩種極端表型的個體構成一個亞群體，僅對該亞群體個體進行選擇性分析，以此大大減少分子標記分析的人力物力花費。雖然極端表型亞群體的個體數(shù)遠少于原群體，但其定位靈敏度和精確度卻不亞于原群體，并可以大大提高分析效率。該方法已經(jīng)成功用于人類和其他動物的遺傳學研究。

通過對甘薯根腐病鑒定分析發(fā)現(xiàn)，在Ｆ１代群體中有大量介于抗感之間的中間類型，如果進行人為劃分會對標記與基因連鎖的分析產(chǎn)生很大的影響，而極端性狀更加容易鑒定，所以選擇性基因型分析結果更加可靠［６］。

研究在進行標記篩選的過程中，有多個相關標記被篩選出來，但是缺乏一定的穩(wěn)定性，而定位的Ｅｃｏ（４５）－Ｍｓｅ（４５）標記則是穩(wěn)定性較好的一個標記，下一步將擴大群體進行遺傳距離的精確定位，同時尋找連鎖更加緊密的標記。

參考文獻：

［１］ 陸漱韻，劉慶昌，李惟基．甘薯育種學［Ｍ］． 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，１９９８．

［２］ 李 鵬，馬代夫，李 強，等．甘薯根腐病的研究現(xiàn)狀與展望［Ｊ］．江蘇農(nóng)業(yè)科學，２００９（１）：１１４－１１６．

［３］ 劉宏謀，李明周．甘薯根腐病發(fā)生規(guī)律中的幾個問題［Ｊ］．植物保護，１９８２（６）：29－30．

［４］ 董星光，方成泉，王 斐，等．梨抗黑星病ＡＦＬＰ標記篩選［Ｊ］．植物病理學報，２０１０，４０（５）：５５２－５５５．

［５］ ＬＥＢＯＷＩＴＺ Ｒ Ｊ，ＳＯＬＬＥＲ Ｍ，ＢＥＣＫＭＡＮＮ Ｊ Ｓ． Ｔｒａｉｔ—ｂａｓｅｄ ａｎａｌｙｓｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｎｋａｇｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍａｒｋｅｒ ｌｏｃｉ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｉｔ ｌｏｃｉ ｉｎ ｃｒｏｓｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｉｎｂｒｅｄｌｉｎｅｓ［Ｊ］． Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９８７，７３：５５６－５６２．

［６］ 李發(fā)玲，李景富，康立功，等．與番茄枯萎病抗病基因Ｉ－１連鎖的ＡＦＬＰ和ＳＳＲ分子標記［Ｊ］．植物保護，２０１１，３7（１）：３７－４０．