豇豆根腐病病原分離鑒定及其核糖體rDNA-ITS序列分析

摘要：采用形態學及分子生物學的方法對采集自武漢的豇豆根腐病分離物進行形態學和分子生物學鑒定。結果表明，菌株ＪＧＦ形態學上為茄腐皮鐮孢菌；對ＪＧＦ菌株的核糖體ＲＮＡ基因內轉錄間隔區（ｒＤＮＡ－ＩＴＳ）進行了ＰＣＲ擴增和序列測定，并在ＧｅｎＢａｎｋ中進行了Ｂｌａｓｔ搜索和比對分析，根據ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列分析結果結合豇豆病株癥狀和病菌的形態學特征，認為武漢地區豇豆根腐病的病原菌為茄腐皮鐮孢菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ Ｓｃｈｌ．）

關鍵詞：豇豆根腐病；形態學；分子鑒定；ｒＤＮＡ－ＩＴＳ分析；Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ Ｓｃｈｌ．

中圖分類號：Ｓ４３６．４３ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）24－5107-03

Pathogeny Isolation and Identification of Cowpea Root Rot Disease and Sequencing

of Ribosomal rDNA-ITS

ＷＵ Ｒｅｎ－ｆｅｎｇ１，ＹＡＮＧ Ｓｈａｏ－ｌｉ１，ＷＡＮ Ｐｅｎｇ２，ＨＵＡＮＧ Ｗｅｉ２

（１． Ｗｕｈａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Vｅｇｅｔａｂｌｅ Sｃｉｅｎｃｅｓ， Ｗｕｈａｎ ４３００６５， Ｃｈｉｎａ

２． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｏｉｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｗｕｈａｎ ４３００６４， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｆｕｎｇａｌ ｉｓｏｌａｔｅ ＪＧＦ ｆｒｏｍ ｃｏｗｐｅａ ｒｏｏｔ rot disease， ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｗｕｈａｎ， ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅ ＪＧＦ ｗｅｒｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ Ｓｃｈｌ． Ｔｈｅ ｒＤＮＡ－ＩＴＳ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅ ＪＧＦ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ． Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ Ｂｌａｓｔ ｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｔｈｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ ｄａｔａｂａｓｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ，ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｏｆ ｃｏｗｐｅａ ｒｏｏｔ rot disease ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ Ｓｃｈｌ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｃｏｗｐｅａ ｒｏｏｔ rot disease； ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ； ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ； ｒＤＮＡ－ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ； Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ Ｓｃｈｌ

豇豆是我國主要蔬菜作物之一，其多季節、多模式、多花色和短周期栽培成為農民增收的主導性蔬菜。湖北常年種植面積４萬ｈｍ２，武漢市豇豆種植面積約０．６７萬ｈｍ２，作為“豇豆之鄉”的武漢市新洲區雙柳街，年種植約０．４萬ｈｍ２次。但是生產中，常因栽培管理不當或環境條件的影響，造成病害的流行，特別是土傳病害。豇豆根腐病（Ｃｏｗｐｅａ ｒｏｏｔ）［１］是豇豆的一種典型的土傳病害，隨豇豆種植年數的增加、面積的擴大、品種的變化等，已成為豇豆上發病最重、危害最大、防治最困難的病害。本研究從武漢地區豇豆種植區采集并分離發病豇豆根腐病病菌，并進行鑒定，為后續的研究提供基礎材料和條件。

１ 材料與方法

１．１ 標本來源與病原菌的分離純化

標樣于２００９年采自武漢市蔬菜科學研究所試驗基地。病原真菌的分離方法參照方中達［２］的植病研究方法有關介紹，選取新發病豇豆植株莖基部的根頸作為分離材料，進行常規組織分離，經單孢純化、培養獲得單孢菌株。

１．２ 致病性測定

采用Ｋｏｃｈｐｓ法將發病組織上分離到的病原菌純培養物（孢子）制成懸浮液（１０５～１０６個孢子／ｍＬ）。采用自然傷根浸孢子液接種植株。取生長良好的無病豇豆苗，用無菌水將根頸部表面沖洗干凈，然后使根完全浸在孢子懸浮液中３０ ｍｉｎ，接種后植株定植于裝有滅菌沙土的花盆中。每個菌株接種 ８株苗，３次重復，以無菌水為對照。植株置于２５ ℃下光照培養箱中，接種后每隔１～２ ｄ觀察１次。發病后，從病斑處再次分離病原菌，確認致病菌。

１．３ 病原菌形態學鑒定

１．３．１ ＰＤＡ上的病菌形態特征觀察 將供試菌株接種到ＰＤＡ培養基上，２５ ℃恒溫培養。７ ｄ后觀察培養基上的菌落形態，制作玻片，光學顯微鏡下觀察分生孢子及分生孢子梗的形態特征，并測量分生孢子的大小。

１．３．２ 產孢表型觀察 產孢表型的觀察采用濾紙片法。參照張天宇［３］的方法，取濾紙剪成比載玻片稍小的長方形，將中心挖一邊長約１０ ｍｍ的方孔，滅菌后用無菌水潤濕放于無菌載玻片上。挑取少量活化的菌絲塊均勻涂于濾紙中央方孔的邊緣，然后將載玻片置于鋪有濕潤濾紙的滅菌培養皿中，２５ ℃恒溫培養。４８ ｈ后顯微鏡下觀察產孢表型。

１．３．３ 形態學鑒定依據 根據菌落形態、生長速度和色素顏色，大型分生孢子的形狀、頂細胞和基細胞的特征，小型分生孢子的有無、形狀和著生方式，分生孢子梗的特征和瓶梗類型，厚垣孢子有無和著生位置等特征，參照Ｂｏｏｔｈ［４］的分類系統進行病原菌種的鑒定。

１．４ 病菌核糖體ＲＮＡ基因內轉錄間隔區（ｒＤＮＡ－ＩＴＳ）序列比較

１．４．１ 菌絲體的培養與收集 將斜面保存的菌株接種在ＰＤＡ培養基上進行活化。將活化后的菌株移接在鋪有滅菌玻璃紙的ＰＤＡ平板上（每皿約３０ ｍＬ培養基），每皿均勻接種２個菌絲塊，每菌株接２～３個平板。于２５ ℃暗培養４～６ ｄ后，用滅菌解剖刀刮取菌絲，置于４ ℃保存備用。

１．４．２ 基因組ＤＮＡ的提取 基因組ＤＮＡ采用十六烷基三甲基溴化銨（Cetrimoｎｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ，ＣＴＡＢ）法提取和純化［５］。將３００ ｍｇ菌絲體放入已滅菌的研缽中，倒入適量液氮充分研磨，將菌絲粉末裝入滅菌的１．５ ｍＬ離心管中。每一離心管中加入６００ μＬ ２×ＣＴＡＢ提取緩沖液（０．７ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ， １００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ， ｐＨ ８．０， ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ， １０ ｇ／Ｌ ＰＶＰ－３６０， ２０ ｇ／Ｌ ＣＴＡＢ， ０．１％β－巰基乙醇），渦旋混勻，６５ ℃水浴鍋中水浴３０ ｍｉｎ，期間顛倒混勻３次。每管加入６００ μｌ氯仿／異戊醇（體積比２４∶１）抽提液，充分混勻后于１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ。吸取上清液至干凈離心管中，加等體積氯仿／異戊醇再抽提１次。將上清液轉入干凈的離心管中，加２倍體積的無水乙醇沉淀２０ ｍｉｎ，１６ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，去上清液，沉淀用７０％乙酸沖洗２次。將離心管置于３７ ℃溫箱中干燥后用ＴＥ溶解沉淀，經１％瓊脂糖凝膠電泳檢測后－２０ ℃冰箱保存備用。

１．４．３ ＩＴＳ擴增 用真核生物核糖體ＤＮＡ通用引物ＩＴＳ１和ＩＴＳ４進行ＰＣＲ擴增［６］。其序列為，ＩＴＳ１：５′－ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ－３′，ＩＴＳ４：５′－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ－３′。

１．４．４ ＰＣＲ反應條件 ＰＣＲ反應體系總體積為５０ μＬ，反應液組分為：１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ，２５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２ ４ μＬ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ ２ μＬ，５ Ｕ／μＬ Ｔａｑ酶０．３ μＬ，模板ＤＮＡ １０ ｎｇ，引物ＩＴＳ１和ＩＴＳ４（２５ μｍｏｌ／Ｌ）各１ μＬ，用ｄｄＨ２Ｏ使總體積達到５０ μＬ，在ＰＴＣ－１００ ＰＣＲ擴增儀上擴增。擴增條件：９５ ℃預變性４ ｍｉｎ；９４ ℃變性１ ｍｉｎ；５４ ℃退火１ ｍｉｎ；７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，共３５個循環； ７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ產物委托南京金斯瑞生物公司進行純化和測序。

１．４．５ ＩＴＳ序列分析 將測序所得的菌株的ＤＮＡ－ＩＴＳ序列與ＧｅｎＢａｎｋ中核酸數據庫（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）中的ＩＴＳ區相關序列進行同源性比較。

２ 結果與分析

２．１ 病原菌的分離與培養

從田間采集的發病植株，切取病株莖基部的維管束組織，按常規的組織分離法進行分離。經組織分離，獲得１個根腐病菌菌株ＪＧＦ。進行單孢純化后，用于致病性測定。

２．２ 致病性測定

接種初期植株不顯癥狀，接種１５ ｄ左右見部分植株萎蔫，拔出植株，發現其根部自根尖開始發生褐色病變，由側根延及主根，致整個根系壞死腐爛，剖檢病根，維管束呈紅褐色，并可延及根頸部，對照植株不發病（圖１）。

２．３ 病原菌形態學鑒定

２．３．１ ＰＤＡ上的病菌形態特征觀察 菌株ＪＧＦ在ＰＤＡ平板上培養，其菌落邊緣白色絮狀，生長快，底奶油黃色。菌絲濃密，質地松軟，隆起。大型分生孢子較易產生，彎或直筒形，兩端鈍圓，較腫，多數為３隔，大小為２０．６～４８．８ μｍ×２．５～４．０ μｍ；小型分生孢子微彎，為卵形或橢圓形，０～１個分隔，大小為６．４～１０．３ μｍ×２．５～３．６ μｍ；厚垣孢子較易產生，頂生或間生，單個球形或成對頂生，細胞壁粗糙（圖２）。

２．３．２ 產孢表型觀察 保濕培養２４ ｈ后在濾紙上可以觀察到濾紙孔邊緣的薄層菌絲向中央生長。培養４８ ｈ后在顯微鏡下觀察菌絲直徑、產孢表型。氣生菌絲有隔、無色、細長多分枝，產生２種孢子，即大型分生孢子和小型分生孢子。大型分生孢子紡錘形至鐮刀形，多數為３隔，大小為２０．６～４８．８ μｍ×２．５～４．０ μｍ；小型分生孢子梗發達而細長，分生孢子 ０～１個分隔，卵形至腎形，假頭狀著生，大小為６．４～１０．３ μｍ×２．５～３．６ μｍ（圖３ａ，ｂ，ｃ）。菌落生長１０ ｄ左右大量產生厚垣孢子，厚垣孢子頂生或間生，多數單個，球形，直徑７～１０ μｍ（圖３）。

２．３．３ 病原形態學鑒定 通過對ＪＧＦ菌株菌落形態、色素顏色、分生孢子梗、大小分生孢子形態，厚垣孢子形態等特征描述，參照Ｂｏｏｔｈ檢索方法確定，該豇豆根腐病病原為半知菌亞門茄腐皮鐮孢菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ Ｓｃｈｌ．）。

２．４ ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列分析

豇豆根腐病菌ＰＣＲ產物經１％瓊脂糖凝膠電泳，獲得一個約為５６０ ｂｐ的擴增條帶，與期望值相符。ＰＣＲ產物送南京金斯瑞生物公司進行序列測序結果表明，目的片段由５６６個核苷酸組成，測序結果與ＧｅｎＢａｎｋ中的序列用ＢＬＡＳＴ軟件進行同源性分析。ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列分析表明，所分離的病原菌與ＧｅｎＢａｎｋ中已公布的Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ（ＧｅｎＢａｎｋ登錄號為ＧＱ３６５１５４、ＡＢ４７０９０３、ＥＦ１５２４２６、ＡＢ３６９４８８、

ＡＪ６０８９８９）相應片段完全一致，同源性為１００％，能夠比對上的堿基數目最多，Ｅ－ｖａｌｕｅ值為最小值０。根據生物信息學同源性比對的結果，將該菌鑒定為茄腐皮鐮孢菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ Ｓｃｈｌ．）。此結果與形態學鑒定結果一致。

３ 小結與討論

本研究在真菌鑒定上以形態學鑒定為基礎，分子鑒定為補充，ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列分析結果作為形態學鑒定的輔助驗證［７］。在病原菌鑒定中，主要根據病菌在ＰＤＡ和其他培養基上的菌落形態、色素、大型分生孢子、小型分生孢子和厚垣孢子的形態特征以及產孢表型參照Ｂｏｏｔｈ分類系統進行種級鑒定。根據孢子的形態和產孢表型將根腐病菌的菌株鑒定為Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ Ｓｃｈｌ．。在形態學鑒定的基礎上，通過對病原菌ｒＤＮＡ－ＩＴＳ區擴增所得序列與ＧｅｎｅＢａｎｋ中的序列進行同源性比較。結果表明，根腐病菌株與Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ Ｓｃｈｌ．的同源性最高為１００％，進一步驗證了形態學鑒定結果。

參考文獻：

［１］ 呂佩珂，李明遠，吳鉅文． 中國蔬菜病蟲原色圖譜［Ｍ］． 北京：中國農業出版社，１９９２．

［２］ 方中達． 植病研究法［Ｍ］．第三版．北京：中國農業出版社，１９９８．

［３］ 張天宇．中國真菌志（第十六卷）鏈格孢屬［Ｍ］．北京：科學出版社，２００３．

［４］ ＢＯＯＴＨ Ｃ． Ｔｈｅ Ｇｅｎｕｓ Ｆｕｓａｒｉｕｍ［Ｍ］． Ｌｏｎｄｏｎ： Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｅａｓｔｅｒｎ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ Ｌｏｎｄｏｎ ａｎｄ Ｒｅａｄｉｎｇ，１９７１．

［５］ ＧＲＡＨＡＭ Ｇ Ｃ， ＭＡＹＳＥＲ Ｓ Ｐ， ＨＥＮＲＹ Ｒ Ｊ． Ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｇａｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｏｒ ＰＣＲ ａｎｄ ＲＡＰＤ ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９４，１６：４８－５１．

［６］ 劉春來，文景芝，楊明秀，等．ｒＤＮＡ－ＩＴＳ在植物病原真菌分子檢測中的應用［Ｊ］．東北農業大學學報，２００７，３８（１）：１０１－１０６．

［７］ 孫廣宇，彭友良，李振岐，等． 核苷酸序列分析在真菌系統學研究中的應用［Ｊ］．西北農林科技大學學報（自然科學版），２００３，３１（６）：１８７－１９１．