水稻白葉枯病抗性基因Xa23的分子標記優化及應用

摘要：結合生物信息學的方法，對水稻白葉枯病（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ． oｒｙｚａｅ，Ｘｏｏ）抗性基因Ｘａ２３的標記Ｃ１８９進行了改良和優化，獲得了測序品種日本晴中Ｃ１８９電子克隆的序列，設計改良的分子標記，命名為Ｐ２３。用Ｐ２３擴增３６個水稻親本和２００份中國栽培稻微核心種質材料，研究了該分子標記的穩定性和特異性。標記多態性檢測結果表明，在陽性親本ＣＢＢ２３中擴增出大約４７４ ｂｐ的條帶，其他３５個常用水稻親本中都是擴增出約６００ ｂｐ的條帶；中國栽培稻微核心種質中１５０個品種擴增出約６００ ｂｐ的單一條帶，５０個品種擴增出約４７４ ｂｐ的單一條帶。利用Ｐ２３對含Ｘａ２３基因的１１４個Ｆ６代育種家系進行了分子標記輔助選擇，獲得了４３個純合的抗性株系。這些結果證明標記Ｐ２３具有特異性強，共顯性，ＰＣＲ擴增產物差異大，利用１％的瓊脂糖凝膠電泳即可快速分清等位差異的特點，能廣泛用于抗病基因Ｘａ２３的輔助選擇；該研究中采用的生物信息學的方法對其他基因分子標記的設計或改良也具有一定的借鑒和指導意義。

關鍵詞：水稻；白葉枯病（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ． oｒｙｚａｅ，Ｘｏｏ）；分子標記輔助選擇；生物信息學

中圖分類號：Ｓ５１１；Ｓ３３０；Ｓ３３６ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）24－5243-04

Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｂｌｉｇｈｔ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｇｅｎｅ Ｘａ２３ ｉｎ Ｒｉｃｅ

ＺＨＯＵ Ｌｅｉ１，ＣＨＥＮ Ｚｈｉ－ｊｕｎ１，ＭＡ Ｙｉｎ－ｈｕａ１，２，ＬＩＵ Ｋａｉ１，ＬＩ Ｓａｎ－ｈｅ１，ＹＡＮＧ Ｇｕｏ－ｃａｉ１， ＨＵ Ｇａｎｇ１，

ＷＡＮ Ｌｉ－ｙｕｎ１，ＹＯＵ Ａｉ－ｑｉｎｇ１

（１． Ｆｏｏｄ Ｃｒｏｐｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｕｈａｎ ４３００６４，Ｃｈｉｎａ；

２． Ｇｒａｄｕａｔｅ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｗｕｈａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００７２，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｃ１８９， ａ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｂｌｉｇｈｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ Ｘａ２３， ｗａｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｅ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｃ１８９ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ｒｉｃｅ ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ， ａｎｄ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍａｒｋｅｒ， ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｎａｍｅｄ ａｓ Ｐ２３． Ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｐ２３ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｉｓ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ ３６ ｐｒｉｍａｌ ｐａｒｅｎｔｓ ａｎｄ ａ ｓｅｔ ｏｆ ｍｉｎｉ－ｃｏｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ． ｉｎ Ｃｈｉｎａ． Ｍａｒｋｅｒ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｔｅｓｔ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｂａｎｄ ａｂｏｕｔ ６００ ｂｐ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ３５ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｉｍａｌ ｐａｒｅｎｔｓ ａｎｄ １５０ ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ ｉｎ ｍｉｎｉ－ｃｏｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ． ｉｎ Ｃｈｉｎａ； Wｈｉｌｅ ａ ４７４ ｂｐ ｂａｎｄ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐａｒｅｎｔ ＣＢＢ２３ ａｎｄ ５０ ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ． ４３ ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｌｉｎｅｓ ｏｕｔ ｏｆ １１４ ｌｉｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｆ６ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｃａｒｒｙｉｎｇ Ｘａ２３ ｇｅｎｅ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ Ｐ２３． Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍａｒｋｅｒ Ｐ２３ ｗａｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃ， ｃｏ－ｄｏｍｉｎａｎｔ， ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｓｉｚｅ， ｃｏｕｌｄ ｓｅｐｅｒｒａｔｅ ａｌｌｅｌｅｓ ｑｕｉｃｋｌｙ ｂｙ ｕｓｉｎｇ １％ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ａｎｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｗｉｄｅｌｙ ａｐｐｌｉｅｄ ｆｏｒ ＭＡＳ ｏｆ Ｘａ２３． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｍｅｔｈｏｄ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ａ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｔｕｄｉｅｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒｉｃｅ； ｗｈｉｔｅ ｌｅａｆ ｂｌｉｇｈｔ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ． oｒｙｚａｅ，Ｘｏｏ）； ＭＡＳ； ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ

水稻是我國和世界上最重要的糧食作物之一。近年來我國水稻播種面積為２ ８００萬～３ ２００萬ｈｍ２［１］。白葉枯病（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ． ｏｒｙｚａｅ，Ｘｏｏ）是目前世界水稻生產中的三大病害之一，一般病田減產２０％～３０％，重病田損失可達８０％，甚至顆粒無收［２，３］。目前生產上主要通過化學農藥防治和種植抗性品種來控制水稻白葉枯病。與發展新型高效、低毒的農藥相比，培育具有白葉枯病抗性基因的水稻新品種是控制水稻白葉枯病蔓延的一種更為經濟、有效的途徑。

據國家水稻數據中心網站（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｉｃｅｄａｔａ．ｃｎ／ｇｅｎｅ／ｇｅｎｅ＿ｘａ．ｈｔｍ）統計，截至２０１０年８月，經國際注冊確認和期刊報道的水稻白葉枯病抗性基因共３５個。其中２４個為顯性基因Ｘａ，其他為隱性基因ｘａ；已被定位的抗性基因有２４個，并且Ｘａ１、ｘａ５、ｘａ１３、Ｘａ２１、Ｘａ２３、Ｘａ２６、Ｘａ２７這７個基因已成功克隆。在眾多的白葉枯病抗性基因中，最為廣泛利用的是Ｘａ３和Ｘａ４基因，由于長期廣泛利用，在國內外許多稻區已喪失抗性［４］。章琦等［５］在普通野生稻中鑒定出一個白葉枯病抗性基因Ｘａ２３，其抗譜較廣，抗國內外２０個白葉枯病鑒別菌株（菲律賓小種１～１０、中國致病型小種１～７和日本小種１～３），且完全顯性，全生育期抗病，后又將Ｘａ２３轉育到栽培稻中，育成了近等基因系ＣＢＢ２３。該基因在雜交稻白葉枯病抗性的改良上具有廣闊的前景［６，７］。對該抗性基因進行分子標記的開發，提高育種上對抗性基因的選擇效率，以迅速地培育出新的抗性品種和推廣應用，這是保障該地區水稻生產安全的關鍵措施。王春連等［７］利用ＥＳＴ標記，把Ｘａ２３精細定位于第１１條染色體上Ｃ１８９和ＣＰ０２６６２之間，遺傳距離分別為０．８ ｃＭ和１．３ ｃＭ。Ｃ１８９與Ｘａ２３基因緊密連鎖，在Ｘａ２３的抗性育種中有很高的選擇效率，是目前分子標記輔助選擇Ｘａ２３基因最常用的分子標記［８－１３］；但是由于Ｃ１８９的ＰＣＲ產物片段較大，在８００ ｂｐ以上，在實際ＭＡＳ應用中不是很方便。

結合生物信息學的方法，以Ｃ１８９的２條引物為探針，電子克隆得到Ｃ１８９的ＰＣＲ產物序列，設計出一對新的分子標記引物，命名為Ｐ２３，并用Ｐ２３擴增３６個水稻親本和一套中國栽培稻微核心種質材料［１４］，研究該分子標記的穩定性和特異性。對含Ｘａ２３基因的１１４個Ｆ６代育種家系進行了分子標記輔助選擇，篩選出純合的Ｘａ２３抗性株系。建立的白葉枯病抗性基因Ｘａ２３的分子標記特異性強，共顯性，ＰＣＲ擴增產物差異大，利用１％的瓊脂糖凝膠電泳即可快速分清等位差異的特點，能快速準確用于抗病基因Ｘａ２３的輔助選擇；利用生物信息學的方法對其他基因分子標記的設計或改良具有一定的借鑒意義。

１ 材料與方法

１．１ 材料

白葉枯病抗性基因Ｘａ２３供體親本ＣＢＢ２３，兩系恢復系“９３１１”等核心骨干親本３６份（表１）；２００份中國栽培稻微核心種質［１４］，種子由中國農業大學李自超課題組提供。

該研究中的分子標記輔助選擇育種家系是一個包括１１４個Ｆ６代育種家系的三系不育系群體。群體的白葉枯病抗性基因Ｘａ２３供體是ＪＤ５１，受體材料為三系不育系天豐Ａ和巨風Ａ；ＪＤ５１是抗褐飛虱親本Ｂ５與白葉枯病抗性基因Ｘａ２３供體親本ＣＢＢ２３的雜交Ｆ６代群體中篩選出的一個聚合了抗褐飛虱基因Ｂｐｈ１４、Ｂｐｈ１５和白葉枯病抗性基因Ｘａ２３的單株。

１．２ 方法

１．２．１ 生物信息學分析 以ＥＳＴ標記Ｃ１８９前后引物序列（Ｃ１８９Ｆ：ＴＡＡ ＧＴＴ ＣＴＡ ＣＡＴ ＣＧＡ ＣＣＣ ＣＡ，Ｃ１８９Ｒ：ＣＡＣ ＡＴＧ ＡＡＧ ＡＧＣ ＴＧＧ ＡＡＡ ＣＧ）為探針，在ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）做序列比對，根據電子克隆到Ｃ１８９的ＰＣＲ產物序列重新設計特異性引物。

１．２．２ 引物設計與合成 引物設計采用軟件Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０，引物序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

１．２．３ 水稻基因組ＤＮＡ提取及ＰＣＲ擴增和電泳 以植株新鮮嫩葉為材料，采用１．５％的ＣＴＡＢ提取總ＤＮＡ［１５］。ＰＣＲ反應體系為１５ μＬ，含１．５ μＬ １０×Ｂｕｆｆｅｒ，０．８ μＬ ｄＮＴＰｓ（１０ ｍｍｏｌ／Ｌ），２條１０ ｍｍｏｌ／Ｌ引物各０．５ μＬ，０．２ μＬ Ｔａｑ酶（５ Ｕ／μＬ），２．０ μＬ模板ＤＮＡ，９．５ μＬ ｄｄＨ２Ｏ。ＰＣＲ反應程序９４ ℃、５ ｍｉｎ，然后３５個循環的９４ ℃、３０ ｓ，５５ ℃、３０ ｓ，７２ ℃、４５ ｓ，最后７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ，擴增產物在１％瓊脂糖凝膠中電泳，用凝膠成像系統掃描照相記錄結果。

２ 結果與分析

２．１ 白葉枯病抗性基因Ｘａ２３分子標記Ｐ２３的建立

利用ＥＳＴ標記Ｃ１８９的２條引物在ＮＣＢＩ上做序列對比，在粳稻日本晴基因組上第１２號染色體上比對得到一個８０２ ｂｐ的序列（圖１），和ＣＢＢ２３的片段一致；而這段序列在秈稻“９３１１”基因組上對應的位置是一個空白，無法得到序列。因此，只對日本晴中的這段序列進行了分析。結果表明，這８０２ｂｐ序列是Ｏｓ１１ｇ０５７９８００基因的基因區的一部分，中間包含一個４５４ ｂｐ的內含子。根據ＥＰＩＣ－ＰＣＲ （Ｅｘｏｎ－ｐｒｉｍｅｄ Ｉｎｔｒｏｎ－ｃｒｏｓｓｉｎｇ ＰＣＲ）［１６］的原理，以這段８０２ｂｐ的序列為模板，跨越內含子設計一對內含子多態性引物Ｐ２３，序列為Ｐ２３Ｆ：５′－ＴＧＣ ＣＡＣ ＡＧＣ ＣＡＡ ＡＧＴ ＡＴＧ ＡＴＧ ＣＴ－３′，Ｐ２３Ｒ：５′－ＴＴＧ ＧＣＣ ＣＣＴ ＧＣＡ ＧＡＧ ＡＡＧ ＧＣ－３′。在粳稻日本晴基因組中電子克隆ＰＣＲ產物的長度為４７４ ｂｐ。

２．２ 分子標記多態性比較

以親本“９３１１”、巨風Ａ、ＣＢＢ２３、ＪＤ５１為模板，用Ｐ２３和Ｃ１８９這２個分子標記分別做ＰＣＲ，用１％瓊脂糖凝膠電泳對比，分別電泳１５ ｍｉｎ和３０ ｍｉｎ，分析親本間的帶型差異。當電泳１５ ｍｉｎ時，Ｐ２３在陰性親本“９３１１”、巨風Ａ的帶型一致，大約為６００ ｂｐ，陽性親本ＣＢＢ２３、ＪＤ５１一致，大約為４７４ ｂｐ，陽性和陰性親本間表現出明顯的差異，而Ｃ１８９在親本間的差異表現不明顯（圖２）。當電泳到３０ ｍｉｎ時Ｃ１８９在親本間也開始表現出差異；而此時Ｐ２３在親本間的差異更大，更加容易分型（圖３）。由此可以看出，Ｐ２３和Ｃ１８９的多態性是一致的，Ｐ２３的改良設計是有效的，而且更易分型，便于應用。

２．３ 分子標記Ｐ２３在水稻親本中的分布

利用分子標記Ｐ２３檢測３６份水稻資源，除ＣＢＢ２３有４７４ ｂｐ條帶外，其余３５份水稻資源均為約６００ ｂｐ的條帶（表１），說明分子標記Ｐ２３是Ｘａ２３的特異性標記。為了進一步檢測Ｐ２３的特異性，檢測了Ｐ２３在２００份中國栽培稻微核心種質的多態性分布。中國栽培稻微核心種質是在６萬多份中國稻種資源中篩選出來的最具代表性的品種，約０．３％的品種保存了全部品種７０．６５％的標記多態性和７６．９７％的表型多態性［１４］。Ｐ２３分子標記檢測的結果顯示，２００個品種都顯示出清晰的單一條帶，其中１５０個品種與“９３１１”一致，顯示出約６００ ｂｐ條帶；５０個品種與ＣＢＢ２３一致，顯示出約４７４ ｂｐ條帶。由于Ｘａ２３來源于野生稻，栽培稻原始品種中不含有該基因，Ｐ２３在７５％的品種中與ＣＢＢ２３表現出多態性，在秈稻品種中更是超過９０％。因此，Ｐ２３在親本品種間的多態性很高，有很廣的適應性。

２．４ 白葉枯病抗性基因的分子標記輔助選擇

Ｃ１８９是Ｘａ２３基因緊密連鎖的標記，前人研究結果表明在ＭＡＳ選擇中選擇效率都在９５％以上，有的達到了１００％，有極高的準確度［８－１３］。Ｐ２３是Ｃ１８９的改良型標記，選擇效率應該和Ｃ１８９是完全一樣的。因此，用Ｐ２３對一個包括１１４個Ｆ６代育種家系的三系不育系群體進行了分子標記輔助選擇。在１１４個家系中，篩選出４３個Ｘａ２３基因的純合家系，部分結果如圖４所示。這４３個育種家系用抗褐飛虱基因Ｂｐｈ１４、Ｂｐｈ１５的分子標記進行檢測，得到了２５個三抗性基因純合的家系。這些純合的抗性育種家系為抗病蟲育種提供了優良的材料。

３ 小結與討論

該研究目的在于開發白葉枯病抗性基因Ｘａ２３實用的分子標記，方便對Ｘａ２３基因的輔助選擇。Ｃ１８９是目前Ｘａ２３的ＭＡＳ育種中最常用的標記［８－１３］。但這個標記擴增的產物過大，育種應用實用性較差。該研究結合生物信息學的方法，以Ｃ１８９的引物為探針，電子克隆得到Ｃ１８９的ＰＣＲ產物，序列分析表明，這段ＰＣＲ產物包括一段內含子序列。前人的研究表明，內含子區域一般承受的選擇壓力要大大低于外顯子區域，內含子變異程度要高于編碼序列［１７］。引物設計在相對保守的外顯子上，比那些引物設計在非編碼區域的分子標記類型具有更廣的應用范圍。因此，利用ＥＰＩＣ－ＰＣＲ的方法來改良Ｃ１８９得到的Ｐ２３的標記多態性檢測結果也證實了這一點。該研究改良的分子標記Ｐ２３具有共顯性、帶型清楚單一、擴增產物小、陽性與非陽性差異明顯、ＰＣＲ分析容易出帶的特點；而且電泳需要時間更短，省時省電，簡便高效。在ＰＣＲ的過程中，短片段的ＰＣＲ對模板和酶的質量要求都會更低一些，更便于利用。因此，該研究結果大大地改良優化了Ｘａ２３基因的分子標記；該研究中采用的生物信息學的方法，也將為對其他基因分子標記的設計或改良提供一定的借鑒意義。

由于水稻白葉枯病菌致病型的變異，原有的水稻品種已經或正在失去抗性。因此，篩選抗性基因培育新的抗性品種是非常必要的。分子標記輔助選擇在水稻白葉枯病抗性育種中已有許多成功的例子［８－１３］，通過研究開發Ｘａ２３的基因標記，篩選出了多個含有Ｘａ２３、Ｂｐｈ１４、Ｂｐｈ１５等多個抗性基因聚合的優良株系，加速了抗性新品種的培育，有利于解決長江中下游地區的水稻白葉枯病抗性問題。

參考文獻：

［１］ 中華人民共和國農業部． 新中國農業６０年統計資料［Ｍ］． 北京：中國農業出版社，２００９．

［２］ ＳＩＮＧＨ Ｇ Ｐ，ＳＲＩＶＡＳＴＡＶＡ Ｍ Ｋ，ＳＩＮＧＨＲ Ｖ，ｅｔ ａｌ． Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ｌｏｓｓｅｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｂｌｉｇｈｔ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｒｉｃｅ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ［Ｊ］． Ｉｎｄｉａｎ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈ，１９９７，３０：１８０－１８５．

［３］ 翟文學，朱立煌． 水稻白葉枯病抗性基因的研究與分子育種［Ｊ］． 生物工程進展，１９９９，１９（６）：９－１５．

［４］ 章 琦，王春連，趙開軍，等． 攜有抗白葉枯病新基因Ｘａ２３水稻近等基因系的構建及應用［Ｊ］． 中國水稻科學，２００２，１６（３）：２０６－２１０．

［５］ 章 琦，趙炳宇，趙開軍，等． 普通野生稻的抗水稻白葉枯病（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ． ｏｒｙｚａｅ）新基因Ｘａ－２３（ｔ）的鑒定和分子標記定位［Ｊ］． 作物學報，２０００，２６（５）：５３６－５４２．

［６］ ＺＨＡＮＧ Ｑ，ＷＡＮＧ Ｃ Ｌ，ＺＨＡＯ Ｋ Ｊ，ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ａｄｖａｎｃｅｄ ｒｉｃｅ ｌｉｎｅｓ ｗｉｔｈ ｎｅｗ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ Ｘａ２３ ｔｏ ｒｉｃｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｂｌｉｇｈｔ ［Ｊ］． Ｒｉｃｅ Ｇｅｎｅｔ Ｎｅｗｓｌ，２００１，１８：７１－７２．

［７］ 王春連，戚華雄，潘海軍，等． 水稻抗白葉枯病基因Ｘａ２３的ＥＳＴ標記及其在分子育種上的利用［Ｊ］．中國農業科學，２００５，３８（１０）：１９９６－２００１．

［８］ 李進波，王春連，夏明元，等． 分子標記輔助選擇Ｘａ２３基因培育雜交稻抗白葉枯病恢復系［Ｊ］． 作物學報，２００６，３２（１０）：１４２３－１４２９．

［９］ 陳建民，付志英，權寶權． 分子標記輔助培育雙抗稻瘟病和白葉枯病雜交稻恢復系［Ｊ］． 分子植物育種，２００９，７（３）：４６５－４７０．

［１０］ 陽海寧，韋紹麗，李孝瓊，等． 標記輔助培育水稻抗稻褐飛虱和稻白葉枯病基因聚合系［Ｊ］． 分子植物育種，２０１０，８（１）：１１－１９．

［１１］ 于 潔，王耀雯，馬文清，等． 水稻抗白葉枯病基因Ｘａ２３群體的ＭＡＳ育種研究［Ｊ］． 華南農業大學學報，２０１０，３１（４）：１－５．

［１２］ 劉 艷，王逸超，樊繼偉，等． 分子標記輔助選擇Ｘａ２３基因在選育抗白葉枯病水稻新品系中的應用［Ｊ］． 浙江農業學報，２０１１，２３（２）：２４８－２５１．

［１３］ 范宏環，王林友，張禮霞，等． 通過分子標記輔助選擇技術選育攜有水稻白葉枯病抗性基因Ｘａ２３的水稻株系［Ｊ］． 中國水稻科學，２０１１，２５（３）：３３１－３３４．

［１４］ ＺＨＡＮＧ Ｈ Ｌ，ＺＨＡＮＧ Ｄ Ｌ，ＷＡＮＧ Ｍ Ｘ，ｅｔ ａｌ． Ａ ｃｏｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｉｎｉ ｃｏｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ． ｉｎ Ｃｈｉｎａ［Ｊ］． Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ，２０１１，１２２（1）：４９－６１．

［１５］ ＲＯＧＥＲＳ Ｏ Ｓ，ＢＥＮＤＩＣＨ Ａ Ｊ． Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｍａｎｕａｌ，１９８８，６：１-１０．

［１６］ ＢＩＥＭＥ Ｎ，ＬＥＨＮＥＲＴ Ｓ Ａ，ＢＥＤＩＥＲ Ｅ，ｅｔ ａｌ． Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｉｎｔｒｏｎ－ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎ ｐｅｎａｅｉｄ ｓｈｒｉｍｐｓ ｕｓｉｎｇ ｅｘｏｎ－ｐｒｉｍｅｄ ｉｎｔｒｏｎ－ｃｒｏｓｓｉｎｇ （ＥＰＩＣ）－ＰＣＲ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｅｃｏｌ，２０００，９（２）：２３３－２３５．

［１７］ 楊 龍． 利用ｃＤＮＡ－ＥＳＴ序列大規模開發內含子多態性標記的研究［Ｄ］． 杭州：浙江大學，２００８．