發酵方式對放線菌WS-22011次生代謝產物的影響

摘要：以放線菌ＷＳ－２２０１１為研究對象，通過研究搖瓶發酵和發酵罐發酵兩種不同發酵方式下ＷＳ－２２０１１產生的次生代謝產物多樣性及產量隨時間變化的動態趨勢，確定ＷＳ－２２０１１最佳發酵方式及兼顧代謝產物多樣性、產量的最佳發酵時間。結果表明，對于ＷＳ－２２０１１菌株來說，在發酵罐發酵和搖瓶發酵兩種發酵方式下產生的次生代謝產物及多樣性基本一致，兩種發酵方式均可以保證次生代謝產物的多樣性和產量，但次生代謝產物最大總產量出現的時間有所差異，從節約時間及成本考慮，可首選發酵罐發酵；而如果需得到所有的次生代謝產物，則首選搖瓶發酵，且發酵時間需適當延長。通過制備分離得到了４個具有較高活性的化合物，ＬＣ－ＭＳ分析結果表明為碰撞霉素。

關鍵詞：放線菌ＷＳ－２２０１１；發酵；次生代謝產物；產量動態變化

中圖分類號：Ｑ９３９．１３＋２；Ｑ８１５ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）24－5234-03

Effect of Fermentation Methods on Secondary Metabolites of Actinomycete WS-22011

ＺＨＡＮＧ Ｙａ－ｎｉ，ＷＡＮ Ｚｈｏｎｇ－ｙｉ，ＸＵ Ｍｉｎ，ＺＨＡＮＧ Ｚｈｉ－ｇａｎｇ，ＷＡＮＧ Ｙａｎ，ＹＡＮＧ Ｚｉ－ｗｅｎ，ＷＡＮＧ Ｋａｉ－ｍｅｉ

（Ｈｕｂｅｉ Ｂｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ／Ｔｈｅ Ｂｒａｎｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｐｅｓｉｔｉｃｉｄｅ，Ｈｕｂｅｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｗｕｈａｎ ４３００６４，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｆ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ ＷＳ－２２０１１ ｕｎｄｅｒ ｓｈａｋｅ－ｆｌａｓｋ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔａｎｋ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｔｉｍｅ ｉｎ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｔｈ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＷＳ－２２０１１＇ｓ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｗｅｒｅ ｂａｓｉｃａｌｌｙ ｓｉｍｉｌａｒ ｕｎｄｅｒ ｂｏｔｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ， ｂｕｔ ｔｈｅ ｔｉｍｅ ｆｏｒ ｍａｘｉｍｕｍ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｄ． Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ， ｔａｎｋ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗｏｕｌｄ ｂｅ ａ ｂｅｔｔｅｒ ｃｈｏｉｃｅ ｆｏｒ ｓａｖｉｎｇ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｃｏｓｔ； Wｈｉｌｅ ｓｈａｋｅ－ｆｌａｓｋ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｌｏｎｇ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｉｆ ｔｈｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｗａｓ ｉｎ ｆｉｒｓｔ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎ． ４ ａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ， ｐｕｒｒｅｄ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ ｃｏｌｌｉｓｍｙｃｉｎｓ ｂｙ ＬＣ－ＭＳ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ ＷＳ－２２０１１；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ；ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｄｙｎａｍｉｃ

土壤微生物是活性天然產物的重要來源，微生物代謝產物具有極大的化學結構多樣性和復雜性，目前已經發現的具有生物活性的微生物次生代謝產物達２０ ０００多個［１］。代謝產物的多樣性一方面決定于菌株本身的生產能力，另一方面還取決于能夠允許它們產生的發酵條件，特別是發酵培養基組成和培養條件［２，３］。如在對大環內酯類抗生素生物合成途徑的研究中發現，微生物發酵過程中產生的ＮＨ４＋及ＰＯ４３－會抑制抗生素的產生。Ｏｍｕｒａ［４，５］利用磷酸鎂捕獲ＮＨ４＋、用水鋁英石捕獲ＰＯ４３－，成功開發了幾種新的生物活性物質。盡管微生物的物種多樣性決定了其代謝產物的化學結構多樣性，但要盡可能體現此種多樣性的傳遞，必須根據不同產生菌的生理生化特性設計多種不同的發酵培養條件［６］。因此為了保證一個菌株所產生的次生代謝產物的多樣性及產量，有必要采取多種培養基及培養條件［７］。以放線菌ＷＳ－２２０１１為研究對象，通過研究搖瓶發酵和發酵罐發酵兩種不同的發酵方式下ＷＳ－２２０１１產生的次生代謝產物多樣性及產量隨時間變化的動態趨勢，確定ＷＳ－２２０１１最佳的發酵方式及兼顧代謝產物多樣性、產量的最佳發酵時間，在此基礎上對ＷＳ－２２０１１發酵提取液進行次生代謝產物的分離制備，通過ＬＣ－ＭＳ分析確定其化合物結構和活性。

１ 材料與方法

１．１ 材料

１．１．１ 培養基 種子培養基：甘露醇 ２０ ｇ，蛋白胨１０ ｇ，豆油 ０．５ ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ０．３５ ｇ，去離子水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ ７．０～７．２。

１．１．２ 主要儀器 Ｗａｔｅｒ ２６９５高效液相色譜儀（Ｗａｔｅｒｓ ９９６二級管陣列檢測器，色譜工作站Ｍａｓｓｌｙｎｘ Ｖ４．０）；高效制備液相色譜儀（Ｗａｔｅｒｓ ２５２５泵，帶２７６７自動收集系統，２９９６二級管陣列檢測器，色譜工作站Ｍａｓｓｌｙｎｘ Ｖ４．０）；高效液相色譜－質譜聯用儀：Ｗａｔｅｒｓ ２６９５高效液相色譜系統，美國Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ Mｉｃｒｏ?誖質譜儀［電噴霧離子源（ＥＳＩ）］，Ｍａｓｓｌｙｎｘ Ｖ４．１液質聯用分析軟件。

１．１．３ 主要試劑 甲醇（色譜純，德國ＣＮＷ），乙腈（色譜純，德國ＣＮＷ），去離子水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。液質聯用分析所用的高純氮氣購自武漢漢陽鋼廠，純度為９９．９９９％。

1.1.4 菌株 放線菌菌種ＷＳ－２２０１１由湖北省農業科學院生物農藥工程研究中心提供。

１．２ 方法

１．２．１ 種子培養 用無菌接種環從斜面中取少量孢子或菌絲轉入種子培養基中，在旋轉式搖床上２８ ℃、１３０～１４０ ｒ／ｍｉｎ培養９６ ｈ。每次每菌株準備１０瓶。移種前，對每瓶種子取樣鏡檢，以排除有污染的搖瓶。

１．２．２ 搖瓶發酵 待種子培養好時，轉入５００ ｍＬ錐形瓶中（裝樣１００ ｍＬ），接種后的錐形瓶置于旋轉式搖床上２８ ℃、１３０～１４０ ｒ／ｍｉｎ培養５ ｄ。

１．２．３ 發酵罐發酵

１）種子準備。２０ Ｌ發酵罐培養基投料體積為１２ Ｌ。準確稱取各種培養基成分，用去離子水溶解，然后轉入發酵罐中，加入適量聚醚消泡劑（０．１％，Ｖ／Ｖ），用１ ｍｏｌ/L氫氧化鈉調節ｐＨ ７．０～７．２，在１２１ ℃蒸汽滅菌２５～３０ ｍｉｎ，自來水冷卻至２８ ℃。打開進氣閥，空氣通過過濾器除菌后進入罐體，維持罐壓０．０３～０．０５ ＭＰａ。

２）發酵罐接種。在火焰圈的保護下將搖瓶種子由接種口接入發酵罐。

３）發酵罐發酵。打開控制系統，調整空氣流量為１∶１（Ｖ／Ｖ，即每分鐘通過罐體的空氣體積除以罐體容積），溫度設置為２８ ℃自動控制，罐壓為０．０３～０．０５ ＭPａ，攪拌速度為３００ ｒ／ｍｉｎ。

４）取樣及提取。對于搖瓶發酵，從６０ ｈ開始至１８０ ｈ，每１２ ｈ取樣１００ ｍＬ發酵液，置４ ℃冰箱中保存。對于發酵罐發酵，從５０ ｈ開始至１６８ ｈ，每１２ ｈ取樣１００ ｍＬ發酵液，置４ ℃冰箱中保存。

１．２．４ 凍干及提取 對于取出的搖瓶和發酵罐樣品，轉入凍干用不銹鋼小盒中，冷凍干燥。樣品凍干后，用５ ｍＬ ５０％甲醇－水濕潤，然后加入４５ ｍＬ乙酸乙酯，在搖床上１５０ ｒ／ｍｉｎ振蕩萃取１ ｈ。將有機相轉入潔凈燒杯中，真空減壓濃縮至干，加入５ ｍＬ色譜純甲醇溶解樣品，轉入１０ ｍＬ離心管中離心、待檢測。

１．２．５ ＨＰＬＣ方法

１）分析條件。色譜柱：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ Ｃ１８（日本），１５０ ｍｍ × ２ ｍｍ（ｉ．ｄ），粒徑５．０ μｍ；進樣量：３ μＬ；流動相：Ａ（水）、Ｂ（乙腈）（梯度洗脫）；柱溫：４０ ℃；流速：０．３ ｍＬ／ｍｉｎ；檢測條件：ＰＤＡ全波長掃描。使用以下方法進行梯度洗脫，流動相中加入０．２％乙酸［８］。

２）制備條件。色譜柱：美國Ｓｕｎｆｉｒｅ?誖ＯＢＤ Ｃ１８Ｐｒｅｐ 柱，２５０ ｍｍ×１９ ｍｍ（ｉ．ｄ），粒徑１０.0 μｍ；柱溫：室溫；流動相：Ａ（水），Ｂ（乙腈）（梯度洗脫條件如表１）；進樣量：３ ０００ μＬ；流速：２７ ｍＬ／ｍｉｎ；檢測條件：ＰＤＡ全波長掃描。

３）質譜檢測條件。ＭＳ條件：電噴霧電離（ＥＳＩ）；毛細管電壓：３．５ ｋＶ；錐孔電壓：４５ Ｖ；離子源溫度：１００ ℃；脫溶劑氣溫度：３００ ℃；脫溶劑氣體流速：５００ Ｌ／ｈ；錐孔氣體流速：５０ Ｌ／ｈ。

２ 結果與分析

２．１ 不同發酵方式下ＷＳ－２２０１１產生的次生代謝產物多樣性分析

將兩種發酵方式下同一時間點的發酵提取液樣品，分別取１ ｍＬ進行ＨＰＬＣ檢測。檢測結果見圖１，圖1-A為發酵罐發酵提取液ＨＰＬＣ色譜圖，圖1-B為搖瓶發酵提取液ＨＰＬＣ色譜圖。總的來看，對于ＷＳ－２２０１１菌株，在發酵罐發酵和搖瓶發酵兩種發酵方式下產生的次生代謝產物及多樣性基本一致，兩種發酵提取液均在１０.00～２０.00 ｍｉｎ產生了６個次生代謝產物，在圖1-B中為Ｐｅａｋ １１．８７，Ｐｅａｋ １２．７２，Ｐｅａｋ １３．３６，Ｐｅａｋ １６．７７，Ｐｅａｋ １８．２６和Ｐｅａｋ １９．５９，且６個化合物保留時間基本相似，紫外吸收光譜相同。此外，在搖瓶發酵下還產生一個量較少的化合物Ｐｅａｋ １５．７２，在發酵罐方式下并未發現此化合物，其原因可能與發酵罐無搖擺過程有關。

２．２ 不同發酵方式下ＷＳ－２２０１１菌株各次生代謝產物的動態變化

為比較搖瓶發酵和發酵罐發酵兩種方式下ＷＳ－２２０１１各次生代謝產物的動態變化趨勢，該研究將相同取樣時間點的搖瓶發酵提取液和發酵罐發酵提取液的次生代謝產物的峰面積進行對比分析，得到各個化合物的動態變化趨勢圖（圖２）。總的來看，除在發酵罐發酵中并未產生Ｐｅａｋ １５．７２外，其他６個次生代謝產物在搖瓶發酵和發酵罐發酵兩種方式下的產量變化趨勢基本一致，說明兩種發酵方式均可以保證次生代謝產物的多樣性和產量。

從各個化合物的變化趨勢來看，化合物Ｐｅａｋ １１．８７，１３．３６和１６．７７在兩種發酵方式下接種７２ ｈ后有下降的趨勢。而化合物Ｐｅａｋ １２．７２，１８．２６和１９．５９在兩種發酵方式下均從７２ｈ到１４４ ｈ一直保持增長趨勢，但在搖瓶發酵方式下，這３個化合物在１４４ ｈ達到最大后呈下降趨勢。僅在搖瓶發酵下產生的化合物Ｐｅａｋ １５．７２，其產量在各時間點一直保持相對穩定。

２．３ 不同發酵方式下ＷＳ－２２０１１菌株次生代謝產物總產量動態

為分析搖瓶發酵和發酵罐發酵兩種方式下ＷＳ－２２０１１次生代謝產物的產量動態，對兩種發酵方式下ＷＳ－２２０１１次生代謝化合物的峰面積求和，得到各個取樣時間點的次生代謝產物化合物峰的總面積，以取樣時間為橫坐標，各個化合物峰的總面積為縱坐標，繪制出搖瓶發酵和發酵罐發酵兩種方式下ＷＳ－２２０１１次生代謝產物的產量動態趨勢圖（圖３）。從圖３可知，在搖瓶發酵條件下，次生代謝產物峰面積總和最高出現在１３２ ｈ，占各時間全部總產量的１３．４９％，這表明采用搖瓶發酵，ＷＳ－２２０１１次生代謝產物在接種后的１３２ ｈ產量達到最高峰，發酵可在此時結束。在發酵罐發酵條件下，次生代謝產物峰面積總和最高出現在８４ ｈ，占總產量的１１．１１％，這表明采用發酵罐發酵ＷＳ－２２０１１次生代謝產物的產量在接種后的８４ ｈ達到最高峰，發酵可結束。

２．４ 次生代謝產物制備分離及ＬＣ－ＭＳ化學結構分析

為制備得到ＷＳ－２２０１１次生代謝產物，將ＷＳ－２２０１１發酵提取液進行次生代謝產物的分離制備。在表１的梯度條件下進行制備性分離純化，制備色譜圖如圖４所示，通過此方法分離到４個化合物（Ｐｅａｋ １３．４２、Ｐｅａｋ １４．５０、Ｐｅａｋ １６．６５和Ｐｅａｋ １９．２２）。ＨＰＬＣ分析表明這４個化合物均為單一峰，表明化合物的純度較高。

對各組分進行ＬＣ－ＭＳ質譜分析表明，這４個化合物的相對分子質量分別為２７５（Ｐｅａｋ １４．５０）、２７５（Ｐｅａｋ １６．６５）、２５７（Ｐｅａｋ １９．２２）和３０３（Ｐｅａｋ １３．４２），其紫外吸收光譜分別為２４３ ｎｍ；２４５ ｎｍ；２３８、２９０ ｎｍ；２５５、３０３ ｎｍ。通過與文獻［９，１０］比對結果表明，以上４種化合物與碰撞霉素性質相近，綜合利用質譜及紫外圖譜數據可確定此４個化合物為碰撞霉素（Ｃｏｌｌｉｓｍｙｃｉｎ）Ａ（Ｐｅａｋ １４．５０）、Ｂ（Ｐｅａｋ １６．６５）、Ｄ（Ｐｅａｋ １９．２２） 和Ｅ（Ｐｅａｋ １３．４２），結構如圖５，Ｓｈｉｎｄｏ等［9］和Ｓｔａｄｌｅｒ等［１０］研究表明，該組分為鏈霉菌屬（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＱ２２產生的非甾體地塞米松－糖皮質激素受體結合抑制劑，具有抗腫瘤細胞活性，由于該抗生素具有較強的抗腫瘤活性及殺蟲除草活性，在農業生物防治方面具有一定的應用價值。

３ 結論

１）在發酵罐發酵和搖瓶發酵兩種發酵方式下，ＷＳ－２２０１１菌株產生的次生代謝產物及多樣性基本一致，其中搖瓶發酵方式多產生一種化合物（Ｐｅａｋ １５．７２），兩種發酵方式均可以保證次生代謝產物的多樣性和產量，但次生代謝產物最大總產量出現的時間有所差異。因此，從節約時間及成本考慮，可首選發酵罐發酵；而如果需得到所有的次生代謝產物，則首選搖瓶發酵，且發酵時間需適當延長。

２）通過對發酵提取液進行次生代謝產物的分離制備，得到４個純度較高的化合物（Ｐｅａｋ １３．４２、Ｐｅａｋ １４．５０、Ｐｅａｋ １６．６５和Ｐｅａｋ １９．２２），經質譜分析，該活性化合物為碰撞霉素。

參考文獻：

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