斑點(diǎn)叉尾天然單鏈(ScFv)噬菌體抗體庫的構(gòu)建及初步鑒定

摘要：以健康未經(jīng)免疫的斑點(diǎn)叉尾■為試驗(yàn)材料，取其新鮮外周血，分離淋巴細(xì)胞，提取總ＲＮＡ，逆轉(zhuǎn)錄合成ｃＤＮＡ。ＰＣＲ擴(kuò)增重鏈Ｆｄ和輕鏈ｃＤＮＡ，以純化的ＶＨ、ＶＬ基因?yàn)槟０澹耘cＶＨ基因３′－端和ＶＬ基因－５′端序列互補(bǔ)的 Ｌｉｎｋｅｒ—Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ為引物，將ＶＨ、ＶＬ隨機(jī)拼接為ＳｃＦｖ。通過酶切連接，依次將ＰＣＲ產(chǎn)物插入質(zhì)粒ｐ３ＭＨ相應(yīng)位點(diǎn)，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ，加入輔助噬菌體ＶＣＳＭ １３，構(gòu)建噬菌體單鏈抗體庫。測定庫容并酶切鑒定。斑點(diǎn)叉尾■天然單鏈（SｃＦｖ）噬菌體抗體庫成功構(gòu)建為進(jìn)一步篩選特異性抗體及從斑點(diǎn)叉尾■病變組織中提取特異性抗原用于免疫治療奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：斑點(diǎn)叉尾■；抗體庫；噬菌體展示；抗體單鏈（SｃＦｖ）

中圖分類號：Ｑ９５９．４６＋８ 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）24－5239-03

Construction and Preliminary Identification of Single-chain Antiboly Library of

Natural Phage in Channel Catfish， Ietalurus punetaus

WANG Hui1，ZOU Shi-ping2

（1. College of Fisheries，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China；

2.Yangtze River Fisheries Reserch Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Wuhan 430223，China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ２５０ ｍL ｂｌｏｏｄ， ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ５０ ｎｏｎ－ｉｍｍｕｎｎｉｚｅｄ ｈｅａｌｔｈｙ ｃｈａｎｎｅｌ ｃａｔｆｉｓｈ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅｉｒ ｖｅｎａ ｃａｕｄａｌｉｓ． Ｔｈｅ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ Ｆｄ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｗｅｒｅ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｃｔｅｄ ｂｙ Ｌｉｎｋｅｒ—Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ ｉｎｔｏ ＳｃＦｖ．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ｌｉｇａｔｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅｌｙ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｐｈａｇｅｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒ ｐ３ＭＨ， ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｌｉｇａｔｅｄ ｓａｍｐｌｅ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ ＸＬ１－Ｂｌｕｅ． Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ＶＣＳＭ １３ ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ ｔｏ ｙｉｅｌｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｈａｇｅ SｃＦｖ ａｎｔｉｂｏｄｙ． Ｔｈｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎａiｖｅ ｃｈａｎｎｅｌ ｃａｔｆｉｓｈ ｐｈａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｒｅａｔｅd ｆａｖｏｕｒａｂｌｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｈａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ａｂｓｔｒａｃｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ ｐｕｎｃｔａｔｕｓ Ｒａｆｉｎｅｓｑｕｅ； ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ； ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｈａｇｅ； SｃＦｖ

斑點(diǎn)叉尾■（Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ ｐｕｎｃｔａｔｕｓ Ｒａｆｉｎｅｓｑｕｅ）亦稱溝鯰（Ｃｈａｎｎｅｌ ｃａｔｆｉｓｈ），屬于鯰形目（Ｓｉｌｕｒｉｆｏｒｍｅｓ）■科（Ｉeｔａｌｕｒｉｄａｅ）魚類。主要分布于美國中部、加拿大南部和大西洋沿岸的部分地區(qū)。斑點(diǎn)叉尾■是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中最為重要的養(yǎng)殖魚種之一，自２０世紀(jì)８０年代引進(jìn)我國以來養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，出口量也在逐年上升。但是由于斑點(diǎn)叉尾■種質(zhì)資源退化嚴(yán)重，養(yǎng)殖技術(shù)較低，養(yǎng)殖環(huán)境惡化等原因，導(dǎo)致人工養(yǎng)殖的斑點(diǎn)叉尾■病害頻發(fā)，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失。斑點(diǎn)叉尾■疾病防治應(yīng)當(dāng)堅持“預(yù)防為主，防重于治”的原則。

噬菌體抗體是指采用基因克隆技術(shù)將Ｂ細(xì)胞全套可變區(qū)基因克隆出來，通過與噬菌體衣殼蛋白基因連接，以融合蛋白的形式表達(dá)在噬菌體表面的抗體分子。用Ｂ淋巴細(xì)胞全套抗體可變區(qū)基因克隆并組裝成的噬菌體群體稱為噬菌體抗體庫［１］。該技術(shù)克服了單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞中抗體不穩(wěn)定、容易丟失的弊端，直接利用抗原從抗體庫中篩選特異性抗體［2-4］。本實(shí)驗(yàn)室采用未經(jīng)免疫的健康斑點(diǎn)叉尾■外周血單個核細(xì)胞（ＰＢＭＣ）為基因來源，建立斑點(diǎn)叉尾■天然單鏈（SｃＦｖ）噬菌體抗體庫。構(gòu)建的主要目的是為后期篩選抗原特異性抗體打下基礎(chǔ)，篩選出的抗體主要用于斑點(diǎn)叉尾■疾病早期的抗體診斷試劑盒，從而更有效地對斑點(diǎn)叉尾■疾病進(jìn)行防治。

１ 材料與方法

１．１ 材料

淋巴細(xì)胞分離液購自上海超研生物科技有限公司；ＲＮＡ提取純化試劑Ｔｒｉｚｏｌ（ＢｉｏＦｌｕｘ）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ購自ＴａＫａＲａ公司；Ｔ４ ＤＮＡ連接酶購自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；限制性內(nèi)切酶ＳｐｅⅠ、ＸｈｏⅠ、ＳａｃⅠ、ＸｂａⅠ、ｐＭＤ－１８Ｔ Ｓｉｍｐｌｅ Ｖｅｃｔｏｒ載體及試驗(yàn)所用培養(yǎng)基均購自北京盈信陽光生物技術(shù)有限公司；ＤＮＡ凝膠回收試劑盒，質(zhì)粒純化試劑盒均購自鼎國生物公司。

宿主菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ，由本實(shí)驗(yàn)室保存；輔助噬菌體ＶＣＳＭ １３，來自武漢生物制品研究所；載體ｐ３ＭＨ，由海軍總醫(yī)院王琰教授惠贈，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

引物序列：

Ｐ１（ＶＨＦｏｒ）：５′－ＣＧＧＡＧＣＴＣＡＣＡＣＣＡＧＴＣＣＴＴＴ

ＧＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴＣ－３′

Ｐ２（ＶＨＢａｃｋ）：５′－ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＣＴＧＧＣＴＣＴＴＴ

ＣＴＧＡＡＣＧＴＧＡＣＣＧ －３′

Ｐ３（ＶＬＦｏｒ）：５′－ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴＧＣＴＣＴＴＣＣＡＧＧＡ

ＧＡＡＡＣＡＧＴＣＡＣ －３′

Ｐ４（ＶＬＢａｃｋ）：５′－ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＣＡＣＣＡＣＣＴＴＧ

ＴＴＣＣＴＣＣＡＣＴＧＡＣ－３′

Ｐ５（ＶＨＦｏｒ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＬＢａｃｋ）：５′－ＴＧＧ ＧＧＣ ＧＧＧ ＡＣＣ ＧＴＣ ＡＣＣ ＧＴＣ ＧＧＴ ＧＧＡ ＧＧＣ ＧＧＴ ＴＣＡ ＧＧＣ ＧＧＡ ＧＧＴ ＧＧＣ ＧＧＡ ＧＧＴ ＧＧＣ ＴＣＴ ＧＧＣ ＴＣＧ ＡＴＴ ＧＡＧ ＣＴＣ ＴＣＴ ＣＣＡ－３′

１．２ 試驗(yàn)方法

１）淋巴細(xì)胞的提取和純化。通過尾靜脈從未經(jīng)免疫的多條斑點(diǎn)叉尾■抽取外周靜脈血共２５０ ｍＬ，常規(guī)方法分離ＰＢＭＣ。洗滌計數(shù)后，每１０７個細(xì)胞加１ ｍＬ Ｔｒｉｚｏｌ提取總ＲＮＡ，經(jīng)異丙醇沉淀，７５％乙醇洗滌后溶于１ ｇ／Ｌ ＤＥＰＣ水中，取適量做瓊脂糖凝膠電泳，鑒定ＲＮＡ質(zhì)量，并用紫外分光光度計測定ＲＮＡ濃度，其余保存于－７０ ℃。

２）逆轉(zhuǎn)錄ｃＤＮＡ和ＰＣＲ擴(kuò)增ＶＨ段及ＶＬ鏈基因。以ＯｌｉｇｏｄＴ ２０為引物，按照ＴａＫａＲａ產(chǎn)品說明書，將ＲＮＡ逆轉(zhuǎn)錄為ｃＤＮＡ。分別用輕鏈ＶＬ，重鏈ＶＨ引物（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ５）進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增。９５ ℃預(yù)變性５ ｍｉｎ；９４ ℃ ３０ ｓ，６４ ℃（不同引物組合退火溫度不同，波動于５５～６５ ℃之間）３０ ｓ，７２ ℃ ５０ ｓ，３０～３５個循環(huán)；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。

３）以純化的ＶＨ、ＶＬ基因?yàn)槟０澹耘cＶＨ基因３′端和ＶL基因５′端序列互補(bǔ)的Ｐ５為引物，進(jìn)行重疊延伸反應(yīng)，４ μＬ ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＭｇＣｌ２，５ μＬ １０×ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ，０．５μＬ ＢＳＡ（１０ ｍｇ／ｍＬ），２ μＬ ｃＤＮＡ，２８．５ μＬ去離子水，總體積５０ μＬ，反應(yīng)條件為９４ ℃ １ ｍｉｎ，６３ ℃ ４ ｍｉｎ，共７個循環(huán)，將ＶＨ、ＶＬ隨機(jī)拼接為單鏈（ＳｃＦｖ）。

４）單鏈（ＳｃＦｖ）ＰＣＲ產(chǎn)物經(jīng)過電泳，回收，純化，連接Ｔ載體，然后轉(zhuǎn)化ＸＬ１－Bｌｕｅ，提取質(zhì)粒后，經(jīng)ＳａｃⅠ和ＸｂａⅠ雙酶切，１％瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶。將表達(dá)載體p３ＭＨ用同樣的兩個酶進(jìn)行酶切，用１％瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶，再與已經(jīng)回收的輕鏈片斷進(jìn)行連接反應(yīng)（ＰＣＲ產(chǎn)物０．４５ μｇ，線性載體１．４μｇ），４ ℃連接過夜。次日加入２００ μＬ超級感受態(tài)ＸＬ１－Ｂｌｕｅ，進(jìn)行熱激轉(zhuǎn)化（冰浴３０ ｍｉｎ，４２ ℃熱激９０ ｓ，冰浴１～２ ｍｉｎ）。轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后立即加入８００ μｇ預(yù)熱到３７ ℃的ＳＯＣ培養(yǎng)基，３７ ℃，２００ ｒ／ｍｉｎ振蕩１ ｈ。加入１０ ｍＬ ＳＯＣ培養(yǎng)基（含５０ ｍｇ／Ｌ Ｔｅｔ和２５ ｍｇ／Ｌ Ａｍｐ）。取部分菌液鋪ＬＢ－Ａｍｐ瓊脂平板，計算庫容。

５）上述菌液加入ＳＯＣ－Ａｍｐ培養(yǎng)液振蕩１ ｈ后，加入輔助噬菌體ＶＣＳＭ １３約１０１２ PＦＵ，混勻后加入５０ ｍＬ ＳＯＢ培養(yǎng)基，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)２ ｈ，之后加入Ｋａｎａ至７０ ｍｇ／Ｌ，３７ ℃振蕩過夜。次日４ ℃，４ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ，得到上清液，加入聚乙二醇８ ０００及ＮａＣｌ使兩者的終濃度為４０ ｇ／Ｌ和３０ ｇ／Ｌ。振蕩促溶，冰浴３０ ｍｉｎ，９ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心２０ ｍｉｎ，４ ℃。棄上清液，用２ ｍＬ １０ ｇ／Ｌ ＢＳＡ－ＰＢＳ懸浮噬菌體沉淀，１４ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心５ ｍｉｎ，除去殘留的細(xì)菌碎片。收集上清液，加入ＮａＮ３至０．２ ｇ／Ｌ，４ ℃保存。至此，用ＤＮＡ重組的方法，將單鏈基因（ＳｃＦｖ）組合到了噬粒載體，即為ＳｃＦｖ噬菌體表面呈現(xiàn)文庫 。

６）將適量ＯＶＡ－ＳＭＰ、ＯＶＡ－ＳＭＺ分別溶解于０．１ ｍｏｌ／Ｌ pＨ ９．６的碳酸鹽緩沖液中，包被無菌ＥＬＩＳＡ板，１００ μＬ／孔，置于無菌小濕盒４ ℃過夜。次日用ＰＢＳＴ洗板３次后用５％ ＢＳＡ－ＰＢＳ ３７ ℃封閉２ ｈ，棄封閉液，同上洗滌，干燥備用。

７）取等體積１％ ＯＶＡ－ＰＢＳ與庫菌液混合，３７ ℃孵育３０ ｍｉｎ。取包被孔２孔，加入上述混合液１００ μＬ／孔，３７ ℃孵育２ ｈ；同時接種１０ μＬ大腸桿菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ于１０ ｍＬ ＬＢ中，３７ ℃ ２２０ｒ／ｍｉｎ振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。棄去孔中的液體，用１５０ μＬ／孔 ＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０）洗滌，過程中用移液器反復(fù)吹打，重復(fù)洗滌５次，每次５ ｍｉｎ。然后加入１００ μＬ孔甘氨酸－鹽酸洗脫液（pＨ ２．２），３７ ℃孵育３０ ｍｉｎ，再加入７ μＬ／孔 ２ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ中和，之后將液體轉(zhuǎn)移到１０ ｍＬ無菌離心管中，加入２ ｍＬ新鮮制備的大腸桿菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ，３７ ℃孵育３０ ｍｉｎ，分別取１０ μＬ、１ μＬ、０．１ μＬ涂ＬＢ－Ａ－Ｔ平板（Amp 50 μＬ／ｍＬ，Tet 10 μＬ／ｍＬ），３７ ℃培養(yǎng)過夜，計數(shù)菌落數(shù)，測定轉(zhuǎn)化率。其余菌液全部轉(zhuǎn)入１０ ｍＬ ＬＢ培養(yǎng)液（Ｔｅｔ １０ μｇ／ｍＬ）中，加入５ μＬ Ａｍｐ，３７℃振蕩培養(yǎng)１ ｈ，再加入５ μＬ Ａｍｐ，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)１ ｈ，然后再轉(zhuǎn)入１００ ｍＬ ＬＢ培養(yǎng)液（Ａｍｐ ５０ μｇ／ｍＬ，Ｔｅｔ １０ μｇ／ｍＬ）中繼續(xù)培養(yǎng)２ ｈ，加入約１０１２ PＦＵ輔助噬菌體ＶＣＳＭ １３，３７ ℃繼續(xù)培養(yǎng)２ ｈ，再加入卡那霉素終濃度至７０ μｇ／ｍL，３７ ℃ １８０ ｒ／ｍｉｎ振蕩培養(yǎng)過夜。４℃，４ ０００ ｒ／ｍｉｎ 離心１５ ｍｉｎ，收集上清液，加入４ ｇ ＰＥＧ ８０００和３ ｇ ＮａＣｌ，３７ ℃搖床促溶５ ｍｉｎ后冰浴３０ ｍｉｎ，４ ℃ ８ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心３０ ｍｉｎ， 棄上清液，倒置離心管１０ ｍｉｎ瀝干殘液，加入３ ｍＬ 含１％ＢＳＡ的ＴＢＳ重懸沉淀，４ ℃ １２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心５ ｍｉｎ，收集上清液即為次級ＳｃＦｖ噬菌體抗體庫。每一輪篩選后均測定次級庫的滴度并計算噬菌體投入／產(chǎn)出比（回收率） ，作為特異性噬菌體抗體富集的指標(biāo)。

８）單克隆噬菌體抗體的制備。將獲得的單個噬菌體克隆轉(zhuǎn)染新鮮制備的大腸桿菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ，鋪 ＬＢ平板（Ａｍｐ ５０ μｇ／ｍＬ，Ｔｅｔ １０ μｇ／ｍＬ），３７ ℃培養(yǎng)過夜。挑取３０個單菌落，分別接種到２ ｍL ＬＢ培養(yǎng)基中（Ａｍｐ ５０ μｇ／ｍＬ，Ｔｅｔ １０ μｇ／ｍＬ），３７ ℃ 振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入５０ μＬ ＶＣＳＭ １３，３７ ℃ 振蕩培養(yǎng)２ ｈ，之后加入卡那霉素至終濃度７０ μｇ／ｍＬ，３０ ℃振蕩培養(yǎng)過夜。４ ℃，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ， 收集上清液即為單抗。

９）噬菌體單抗的ＥＬＩＳＡ鑒定。用ＥＬＩＳＡ法進(jìn)行抗體特異性結(jié)合性能的鑒定：分別用ＯＶＡ－ＳＭＰ、ＯＶＡ－ＳＭＺ包被酶標(biāo)板，３％ＢＳＡ－ＰＢＳ封閉，之后將上步中單抗用１％ＢＳＡ－ＰＢＳ稀釋１倍加入到酶標(biāo)板中３７ ℃孵育２ ｈ，同時設(shè)空白、ＶＣＳＭ１３、ＯＶＡ做陰性對照。

２ 結(jié)果

２．１ 總ＲＮＡ提取

由圖1可見，甲醛變性電泳顯示ＲＮＡ條帶清晰，２８ｓ、１８ｓ亮度之比約為２∶１，并且可以見到微弱的５ｓ條帶（圖1）。測定Ａ值＞１．８，說明ＲＮＡ無降解，無蛋白污染，可以作為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

２．２ 逆轉(zhuǎn)錄生成ｃＤＮＡ

ｃＤＮＡ 第一鏈電泳顯示ｃＤＮＡ為從２５０～２ ５００ ｂｐ 彌漫性分布的條帶。用設(shè)計的１８ ｓ引物做內(nèi)參，擴(kuò)增后可見明顯１８ ｓ條帶，證明ｃＤＮＡ性質(zhì)良好。

２．４ ＰＣＲ擴(kuò)增重鏈ＶＨ段和輕鏈ＶＬ段

擴(kuò)增的重鏈ＶＨ段和輕鏈ＶＬ段產(chǎn)物經(jīng)過１％瓊脂糖凝膠電泳，在６５０ ｂｐ左右可見較亮特異性條帶。

２．５ 通過Ｌｉｎｋｅｒ連接重鏈ＶＨ段和輕鏈ＶＬ段成單鏈（ＳｃＦｖ）基因

連接重鏈ＶＨ段和輕鏈ＶＬ段成單鏈（ＳｃＦｖ）段產(chǎn)物經(jīng)過１％瓊脂糖凝膠電泳，在１ ４００ ｂｐ左右可見較亮特異性條帶。

２．６ 單鏈（SｃＦｖ）噬菌體抗體的構(gòu)建及鑒定

切下１ ４００ ｂｐ 左右條帶回收后連接Ｔ載體，將κ－Ｔ鏈、λ－Ｔ鏈合并與ｐ３ＭＨ分別用ＳａｃⅠ和ＸｂａⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳可見約１ ４００ ｂｐ和４ ０００ ｂｐ大小的單一條帶，為所需的載體和目的片段。回收后將二者連接，電轉(zhuǎn)化，搖菌擴(kuò)增，提取質(zhì)粒ＤＮＡ，用ＳａｃⅠ和ＸｂａⅠ雙酶切后電泳，顯示出約４ ０００ ｂｐ和約１ ４００ ｂｐ的兩條帶，說明單鏈（SｃＦｖ）庫構(gòu)建成功。所獲得的輕連庫的庫容為５．１×１０７。對隨機(jī)挑選的２０個單菌落進(jìn)行菌液ＰＣＲ，其中１８個可以擴(kuò)增出輕鏈片段，說明重組率為９０％。

２．７ 噬菌體抗體庫的構(gòu)建及鑒定

經(jīng)過提取抗體庫質(zhì)粒ＤＮＡ，分別用ＸｈｏⅠ和ＳｐｅⅠ，ＳａｃⅠ和ＸｂａⅠ雙酶切后電泳，顯示４ １００ ｂｐ和１ ４００ ｂｐ左右條帶；用ＸｈｏⅠ單酶切，顯示約５ ５００ ｂｐ大片段。以噬菌體抗體庫噬粒ＤＮＡ 為模板，以單鏈（SｃＦｖ）引物組合進(jìn)行ＰＣＲ，擴(kuò)增出約１ ４００ ｂｐ的插入片段，說明構(gòu)建抗體庫成功。抗體庫進(jìn)行了４次構(gòu)建， 按照蘭風(fēng)華等［5］的方法計算庫容分別為１．６３×１０７、１．１１×１０７、１．４２×１０７、１．５１×１０７，積累在一起總庫容為５．６７×１０７，單鏈（SｃＦｖ）庫的重組效率達(dá)到９０％。

２．８ 抗體的篩選

分別用ＯＶＡ－ＳＭＰ、ＯＶＡ－ＳＭＺ為固相抗原對噬菌體抗體庫進(jìn)行５輪富集篩選。從表１、表２中可以看出，隨著篩選輪數(shù)的增多，雖然抗原包被量在不斷減少，洗脫次數(shù)不斷增加，抗體的投入產(chǎn)出比仍不斷升高，說明噬菌體抗體得到明顯富集。

２．７ 噬菌體抗體的ＥＬＩＳＡ檢測

挑取單個克隆，小規(guī)模制備抗體后，ＯＶＡ－ＳＭＰ、ＯＶＡ－ＳＭＺ作為包被抗原，設(shè)空白、ＶＣＳＭ１３、ＯＶＡ做陰性對照，對６０個樣進(jìn)行平行檢測，結(jié)果得到ＳＭＰ陽性菌株１１個，ＳＭＺ陽性菌株９個，其余均為陰性。

３ 討論

斑點(diǎn)叉尾■是水產(chǎn)養(yǎng)殖中的重要經(jīng)濟(jì)魚種，在其原產(chǎn)地美國的養(yǎng)殖規(guī)模達(dá)到水產(chǎn)養(yǎng)殖的６０％以上。引進(jìn)我國以來，養(yǎng)殖規(guī)模日益擴(kuò)大，出口量也不斷增加。此次試驗(yàn)我們選擇斑點(diǎn)叉尾■作為建庫對象，不僅是因?yàn)樗谒a(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的重要地位，還在于它是硬骨魚類免疫系統(tǒng)研究較為透徹的模式動物之一。作為硬骨魚類的代表性魚種，斑點(diǎn)叉尾■的優(yōu)勢在于，①目前已經(jīng)積累了大量關(guān)于斑點(diǎn)叉尾■免疫球蛋白結(jié)構(gòu)和功能方面的生物學(xué)信息；②已經(jīng)建立起體外細(xì)胞培養(yǎng)體系，可以利用此體系做抗原遞呈，細(xì)胞融合及溫度對免疫系統(tǒng)影響方面的試驗(yàn)；③已經(jīng)建立起特定類型的無性白細(xì)胞系包括Ｂ細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、Ｔ細(xì)胞及ＮＫ細(xì)胞等［6］。選擇未經(jīng)免疫的斑點(diǎn)叉尾■，分離外周血淋巴細(xì)胞，提取總ＲＮＡ，模擬其體內(nèi)天然的抗體譜，構(gòu)建大庫容噬菌體抗體文庫，為進(jìn)一步篩選特異性抗體打下基礎(chǔ)。

噬菌體抗體庫技術(shù)誕生以來，已經(jīng)取得了巨大的成果，顯示它的強(qiáng)大生命力。它不僅能夠生產(chǎn)具有識別功能的特異性抗體，而且能夠篩選和生產(chǎn)具有催化和切割功能的抗體酶，解決了雜交瘤系統(tǒng)低效及鼠單抗的動物源性難題，對于腫瘤、自身免疫性疾病和感染性疾病發(fā)病機(jī)理的研究、診斷、被動免疫和治療有極為重要的試驗(yàn)價值。

目前認(rèn)為抗體引物的多樣性與細(xì)菌轉(zhuǎn)化率是影響抗體庫容量的主要因素，而庫容的大小與抗體親和力大小成正比。為了獲得親和力高的抗體，本試驗(yàn)從５０尾健康未經(jīng)免疫的斑點(diǎn)叉尾■外周血中分離出淋巴細(xì)胞抽提總ＲＮＡ，經(jīng)１５對特異性引物ＲＴ－ＰＣＲ擴(kuò)增出ＳｃＦｖ抗體基因片段，制備超級感受態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，經(jīng)過四次轉(zhuǎn)化構(gòu)建的庫容為５．６７×１０７。如果要得到接近體內(nèi)Ｂ淋巴細(xì)胞群數(shù)量（約１０８）的抗體庫，必須通過增加轉(zhuǎn)化次數(shù)來累積庫容。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道Lobb等［８］通過上百次的電穿孔轉(zhuǎn)化獲得了１０１０的抗體庫，接近體內(nèi)經(jīng)過人工免疫達(dá)到的抗體水平。接近體內(nèi)經(jīng)過人工免疫達(dá)到的抗體水平。

在從自建的斑點(diǎn)叉尾■天然單鏈（SｃＦｖ）噬菌體抗體庫中篩選得到抗磺胺類藥物的魚源單抗。試驗(yàn)中利用偶聯(lián)卵血清蛋白的兩種磺胺類藥物包被固相，對自建的斑點(diǎn)叉尾■天然單鏈（SｃＦｖ）噬菌體抗體庫進(jìn)行篩選，在篩選過程中，抗原濃度呈半數(shù)遞減，洗脫次數(shù)逐漸增加，以減少親和力弱的抗體的結(jié)合。經(jīng)過５輪的富集淘選，我們得到多株特異性良好的抗體，并證明了所構(gòu)建的噬菌體抗體庫具有良好的多樣性。噬菌體抗體庫技術(shù)的引入使針對性魚源單抗的制備成為可能，也為ＥＬＩＳＡ試劑盒研制所需抗體的制備提供了一種新的方法。

參考文獻(xiàn)：

［１］ ＨＯＯＧＥＮＢＯＯＭ Ｈ Ｒ， ＤＥ ＢＲＵＩＮＥ Ａ Ｐ， ＨＵＦＴＯＮ Ｓ Ｅ， ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］． Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９８，４：１－２０．

［２］ ＷＩＮＴＥＲ Ｇ， ＧＲＩＦＦＩＴＨ Ａ Ｄ， ＨＡＷＫＩＮＳ Ｒ Ｅ， ｅｔ ａｌ． Ｍａｋｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｊ］． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １９９４，１２：４３３－４３７．

［３］ 王 琰，化 冰，劉群英，等． 半合成抗體庫的構(gòu)建及鑒定［Ｊ］． 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，１９９９，１９（３）：２３８－２４１．

［４］ 張建瓊，張雪萍，林 陵，等． 輔助噬菌體擴(kuò)增與定量條件的研究［Ｊ］． 南京鐵道醫(yī)學(xué)院學(xué)報，１９９９（１８）：１３－１５．

［５］ 蘭風(fēng)華，高 輝，劉玉峰，等． 正常人天然ＩｇＧ 抗體噬菌體呈現(xiàn)庫的構(gòu)建［Ｊ］． 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，１９９９（２０）：４６４－４６７．

［６］ 張永生，南海娟，魏新軍． 動物源性食品中磺胺類藥物多殘留檢測方法研究進(jìn)展［Ｊ］． 畜牧與飼料科學(xué)，２００９，３０（３）：３５－３６．

［７］ ＳＴＵＧＥ Ｔ Ｂ， ＹＯＳＨＩＤＡ Ｓ Ｈ， ＣＨＩＮＣＨＡＲ ＶＧ， ｅｔ ａｌ． Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｃｈａｎｎｅｌ ｃａｔｆｉｓｈ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｍｉｘｅｄ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｃｕｌｔｕｒｅｓ［Ｊ］． Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９７；１７７（２）：１５４-１６１.

［８］ ＬＯＢＢ Ｃ Ｊ， ＯＬＳＯＮ Ｍ Ｏ， ＣＬＥＭ Ｌ Ｗ． Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｃｌａｓｓｅｓ ｉｎ ａ ｔｅｌｅｏｓｔ ｆｉｓｈ［Ｊ］． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９８４，１３２（４）：１９１７-１９２３．5