吸水鏈霉菌ATCC29253產(chǎn)Hygrociｎs的條件優(yōu)化

摘要：吸水鏈霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ２９２５３能夠產(chǎn)生多種具有較好生物活性的次級代謝產(chǎn)物，包括雷帕霉素、尼日利亞菌素、洋橄欖葉素、安莎類抗生素Hｙｇｒｏｃｉｎｓ等。通過改變發(fā)酵的溫度、ｐＨ及通氧量，探索菌絲體的最佳生長條件。利用正交試驗優(yōu)化改變培養(yǎng)基中各組分的含量，測試了不同的碳源和氮源對發(fā)酵的影響。優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成為甘油20.0 mL/L，棉子餅粉30.0 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，磷酸氫二鉀1.5 g/L，氯化鈉5.0 g/L，甘露醇20.0 g/L，水解酪蛋白5.0 g/L。優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基不僅明顯提高了ｈｙｇｒｏｃｉｎｓ的產(chǎn)量，同時還較大幅度地促進了雷帕霉素的產(chǎn)生。

關(guān)鍵詞：Ｈｙｇｒｏｃｉｎｓ；雷帕霉素；正交試驗；發(fā)酵培養(yǎng)基

中圖分類號：Ｑ９３５文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）22－4596-05

Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｈｙｇｒｏｃｉｎｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ by

Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ＡＴＣＣ ２９２５３

ＷＵ Ｚｈｕ－ｈｕａ，ＷＡＮＧ Ｍｉｎｇ－ｙａｎ，ＨＥ Ｊｉｎｇ

（Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７０，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ＡＴＣＣ２９２５３ ｃａｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｖａｒｉｏｕｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｗｉｔｈ ｓｔｒｏｎｇ ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ． Ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓ． ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ， ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ｐＨ ｏｆ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｅｒａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ． Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ， ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃａｒｂｏｎ ａｎｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ， ２0.0 mL/L ｇｌｙｃｅｒｏｌ， 30.0 g/L ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ， 1.0 g/L ＫＨ２ＰＯ４， 1.5 g/L Ｋ２ＨＰＯ４， 5.0 g/L ＮａＣｌ， 20.0 g/L ｍａｎｎｉｔｏｌ， 5.0 g/L ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｃａｓｅｉｎ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ｈｉｇｈｌｙ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｈｙｇｒｏｃｉｎｓ ａｎｄ ｒａｐａｍｙｃｉｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： hｙｇｒｏｃｉｎｓ； ｒａｐａｍｙｃｉｎ； ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ； ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ

吸水鏈霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ） ＡＴＣＣ２９２５３是２０世紀７０年代Ｖｅｚｉｎａ等從復活島土壤中分離獲得的一種吸水鏈霉菌。據(jù)報道，該菌除了產(chǎn)生免疫抑制劑雷帕霉素（Ｒａｐａｍｙｃｉｎ）［１］外，在不同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，還可以分泌尼日利亞菌素（Ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ）［２］、洋橄欖葉素（Ｅｌａｉｏｐｈｙｌｉｎ）［３］、六烯類抗生素（Ｈｅｘａｅｎｅｓ）［４］等多種具有生物活性的物質(zhì)，其次級代謝產(chǎn)物非常豐富，其中，雷帕霉素最引人注目。這種無色晶體是由Ⅰ型聚酮合酶催化合成的三烯類３１元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，可強烈抑制白色念珠菌、石膏樣小孢子菌、顆粒發(fā)癬菌及假絲酵母等真菌生長，用作免疫抑制劑，可抗腫瘤，甚至有抗衰老［５］的作用，具有重要的經(jīng)濟價值和應用前景。Ｈｙｇｒｏｃｉｎs Ａ和Ｂ是２００５年美國科學家在雷帕霉素純化過程中發(fā)現(xiàn)的一種與其共結(jié)晶的淺黃色色素［６］。它是由一個苯醌環(huán)上不相連的二個碳原子通過酰胺鍵與脂肪鏈橋連形成的抗生素，屬于萘醌型安莎類抗生素［７］。其主鏈１７個碳原子構(gòu)成的碳骨架比其他安莎類抗生素短，是已知的最小的安莎類抗生素。為了研究Ｈｙｇｒｏｃｉｎｓ的生物合成過程，首先需要測試產(chǎn)生菌在不同的發(fā)酵條件下，菌體生長的狀態(tài)及Ｈｙｇｒｏｃｉｎｓ產(chǎn)量的高低，從而篩選出最適的發(fā)酵條件，建立簡單方便的檢測方法，為后期突變菌株代謝物的鑒定、大量生產(chǎn)和提取奠定基礎(chǔ)。最初按照文獻報道的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基進行了５００ ｍＬ的發(fā)酵試驗，結(jié)果卻并不理想。在發(fā)酵物的ＨＰＬＣ分析中沒有找到符合Ｈｙｇｒｏｃｉｎｓ特征吸收的峰，ＬＣ－ＭＳ分析中也沒有發(fā)現(xiàn)任何與Ｈｙｇｒｏｃｉｎｓ相關(guān)的信號。顯然文獻所報道的發(fā)酵條件并不適合于少量樣品的檢測，有待于進一步優(yōu)化，以提高Ｈｙｇｒｏｃｉｎｓ的產(chǎn)量，從而達到ＨＰＬＣ和ＬＣ－ＭＳ的檢測范圍。試驗通過優(yōu)化發(fā)酵的各種條件，改變培養(yǎng)基的組成，提高了Ｈｙｇｒｏｃｉｎｓ的產(chǎn)量，建立起在小規(guī)模發(fā)酵體系中檢測Ｈｙｇｒｏｃｉｎｓ的方法。

１材料與方法

１．１菌株

吸水鏈霉菌ＡＴＣＣ２９２５３由華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室微生物次級代謝基因工程室保存。

１．２培養(yǎng)基

１．２．１２ＣＭ培養(yǎng)基可溶性淀粉１０ ｇ／Ｌ，胰蛋白胨２ ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４ １ ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ １ ｇ／Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２ ｇ／Ｌ， ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ２ ｇ／Ｌ，碳酸鈣２ ｇ／Ｌ，青島瓊脂２２ ｇ／Ｌ，ｐＨ ７．２，用于目的菌株的活化及孢子計數(shù)。

１．２．２ＴＳＢ液體培養(yǎng)基Ｏｘｏｉｄ ｔｒｙｐｔｏｎｅ ｓｏｙａ ｂｏｒｔｈ ｐｏｗｅｒ ３０ ｇ／Ｌ，無菌水定容，ｐＨ ７．２，用于種子培養(yǎng)用。

１．２．３Ｈｙｇｒｏｃｉｎｓ液體發(fā)酵培養(yǎng)基Ｍ１棉子餅粉 ２０ ｇ／Ｌ，葡萄糖２０ ｇ／Ｌ，酵母提取物５ ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ５ ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４ １ ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４ １ ｇ／Ｌ，甘油 ２０ ｍＬ／Ｌ，補加去離子水至１ Ｌ，初始ｐＨ為６．５。

１．２．４雷帕霉素液體發(fā)酵培養(yǎng)基黃豆餅粉２０ ｇ／Ｌ，葡萄糖２０ ｇ／Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ５ ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４ ５ ｇ／Ｌ，無菌水定容，ｐＨ ６．０。

１．３方法

１．３．１吸水鏈霉菌的種子培養(yǎng)及發(fā)酵用扁頭牙簽蘸取甘油保藏的菌種，在２ＣＭ培養(yǎng)基平板上進行劃線分離。３～４ ｄ后挑取長出的單菌落，接種于含５ ｍＬ ＴＳＢ液體培養(yǎng)基的ＰＡ瓶中，３０ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ搖床培養(yǎng)３～４ ｄ。以１０％的接種量將其轉(zhuǎn)入５０ ｍＬ新鮮的ＴＳＢ液體培養(yǎng)基中，３０ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ繼續(xù)培養(yǎng)４８ ｈ。以１０％的接種量將二次種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中，２６ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ發(fā)酵。

１．３．２吸水鏈霉菌孢子的保藏用滅菌棉簽沾取２０％甘油，從平板上刮下孢子，收集于含甘油的ＰＡ瓶中，經(jīng)孢子過濾器過濾后，５ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，棄上清，沉淀用２０％甘油混勻，每管１ ｍＬ分裝到菌種保藏管中，－２０ ℃保藏。

１．３．３液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化在液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成不變的情況下，利用ＳＰＳＳ １７．０軟件設(shè)計正交試驗，檢測各培養(yǎng)基組分含量變化時，得到菌絲體濕重變化，從而進行液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化。

１．３．４發(fā)酵條件的檢測測試不同發(fā)酵條件包括培養(yǎng)溫度（２６、２８、３０ ℃）、搖床轉(zhuǎn)速（１８０、２００、２５０ ｒ／ｍｉｎ）、ｐＨ（５．５、６．０、６．５、７．０、７．５）下的菌絲體濕重。

１．３．５菌絲體生長測定研究以菌絲體濕重為檢測指標。具體做法是250 mL搖瓶中裝入50 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基，按10%的比例接種二級種子培養(yǎng)液，６ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，棄上清，用吸水紙慢慢將殘余的液體吸走，得到的菌絲體稱重。

１．３．６發(fā)酵產(chǎn)物的提取與檢測利用優(yōu)化后的發(fā)酵條件進行鏈霉菌的發(fā)酵，離心收集菌絲體。加入50 mL的丙酮萃取2次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后用乙醚溶解，通過HPLC（Waters e2695）檢測發(fā)酵產(chǎn)物中雷帕霉素和Hygrocins的產(chǎn)量變化情況。色譜柱為Ｃ１８（５ μｍ，４．６ ｍｍ×３００ ｍｍ）。ＨＰＬＣ條件：梯度洗脫，流動相組為乙腈和水；流速：１．０ ｍＬ／ｍｉｎ；檢測波長：２７５ｎｍ及３１６ ｎｍ。

２結(jié)果與分析

２．１Ｓ． ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ＡＴＣＣ２９２５３的生長曲線

吸水鏈霉菌以菌絲體狀態(tài)在液體培養(yǎng)基中不均勻分布，無法像大腸桿菌一樣通過測定吸光度的方法監(jiān)測其生長過程。研究以菌絲體濕重為檢測指標，監(jiān)測了Ｓ． ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ＡＴＣＣ２９２５３的生長變化，繪制出其生長曲線如圖１所示。由圖１可知，在１～９ ｄ的生長過程中，菌絲體量在不斷增加，第９天時菌絲體量達到最大。９ ｄ后菌絲體量開始逐漸減小。Ｈｙｇｒｏｃｉｎｓ和雷帕霉素都是從吸水鏈霉菌菌絲體中分離到的，菌絲體的生長狀態(tài)及菌絲體的產(chǎn)量都極可能影響這些抗生素的產(chǎn)量［８］。

２．２發(fā)酵條件的優(yōu)化

Ｓａｌｌａｍ等［９］對Ｓ． ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ＡＴＣＣ２９２５３中影響雷帕霉素產(chǎn)量的生理學因素進行了分析，研究借鑒雷帕霉素的分析結(jié)果，對發(fā)酵培養(yǎng)基的初始ｐＨ、發(fā)酵溫度和通氧量（通過改變轉(zhuǎn)速控制）等不同發(fā)酵條件下菌絲體的生長狀態(tài)進行了檢測。

從圖２、圖３、圖４可以看出，在其他條件不變的情況下，當搖床轉(zhuǎn)速為２５０ ｒ／ｍｉｎ時，菌絲體生長最快；２８ ℃時菌絲體產(chǎn)量明顯高于其他溫度水平；當發(fā)酵液的初始ｐＨ為６．５時，菌絲體產(chǎn)量最高。鏈霉菌作為一種好氧菌，搖床轉(zhuǎn)速越高，通氧量就越高，更適合于菌絲體的形成分化、次級代謝產(chǎn)物的合成。研究表明，在２０～３５ ℃時鏈霉菌均能正常生長，但不同的溫度或ｐＨ條件下微生物體內(nèi)酶的活性會有差異，可能影響微生物的各種生命活動。

２．３均勻設(shè)計優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基各組分含量

正交設(shè)計液體發(fā)酵培養(yǎng)基的結(jié)果見表１。試驗中液體發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)組成為葡萄糖１０．０ ｇ／Ｌ，酵母提取物７．５ ｇ／Ｌ，甘油２０．０ ｍＬ／Ｌ，棉子餅粉 ３０．０ ｇ／Ｌ，磷酸二氫鉀１．０ ｇ／Ｌ，磷酸氫二鉀１．５ ｇ／Ｌ，氯化鈉５．０ ｇ／Ｌ，各組分對菌絲體產(chǎn)量的影響力為棉子餅粉＞葡萄糖＞磷酸氫二鉀＞酵母提取物＞磷酸二氫鉀＞氯化鈉＞甘油。

２．４主要營養(yǎng)物質(zhì)對發(fā)酵結(jié)果的影響

２．４．１碳源的篩選在其他組分不變的情況下，改變碳源的組成，以20.0 ｇ／Ｌ葡萄糖作為對照，其他試驗組分別以20.0 ｇ／Ｌ玉米淀粉、20.0 ｇ／Ｌ麥芽糖、20.0 ｇ／Ｌ蔗糖、20.0 ｇ／Ｌ甘露醇、20.0 ｇ／Ｌ可溶性淀粉作為碳源進行單因子試驗。結(jié)果（圖５）表明，添加20.0 ｇ／Ｌ的甘露醇時，菌絲體生長最快，產(chǎn)量最高。

２．４．２氮源的篩選在其他組分不變的情況下，改變氮源的組成，以5.0 g/L酵母提取物作為對照組，其他試驗組分別以5.0 g/L胰蛋白胨、5.0 g/L麥芽提取物、5.0 g/L水解酪蛋白取代5.0 g/L酵母提取物作為氮源進行單因子試驗。結(jié)果（圖６）表明，以5.0 g/L水解酪蛋白取代酵母提取物作為氮源能夠顯著提高菌絲體的產(chǎn)量。

２．５發(fā)酵產(chǎn)物的鑒定

Ｓ． ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ATCC 29253在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵７ ｄ后產(chǎn)生有明顯抑菌活性的物質(zhì)。根據(jù)報道，該菌除了產(chǎn)生Ｈｙｇｒｏｃｉｎｓ外，還分泌多種次生代謝產(chǎn)物， 其中，雷帕霉素、尼日利亞菌素抗革蘭氏陽性菌、真菌，洋橄欖葉素抗細菌，六烯類抗生素抗真菌。從各個代謝產(chǎn)物的抗菌譜可以看出該鏈霉菌的抗細菌和抗真菌活性都是多種組分共同作用的結(jié)果。僅僅是某個抗性物質(zhì)的缺失并不會使得該鏈霉菌喪失抗細菌或抗真菌活性，因此無法利用生物活性測定來快速檢測Ｈｙｇｒｏｃｉｎｓ的產(chǎn)生與否。

分別使用１５０ ｍＬ優(yōu)化后液體發(fā)酵培養(yǎng)基Ｍ２與初始發(fā)酵培養(yǎng)基Ｍ１進行小規(guī)模發(fā)酵試驗，其他條件相同。發(fā)酵所得菌絲體量分別為４０．３７和２８．３４ ｇ，萃取后進行ＨＰＬＣ和ＬＣ－ＭＳ分析，僅在Ｍ２的發(fā)酵物中檢測到Ｈｙｇｒｏｃｉｎｓ的信號（圖７），其吸收峰保留時間為２２．６９ ｍｉｎ，最大吸收波長為２７５ ｎｍ和３１６ ｎｍ，ｍ／ｚ為５０８．１７１ ６，與文獻報道的Ｈｙｇｒｏｃｉｎs Ｂ的各項特征相符。ＬＣ－ＭＳ分析中也檢測到了Ｈｙｇｒｏｃｉｎs Ａ的吸收峰，但是由于其含量太低，無法在ＨＰＬＣ中尋找到相應的峰圖。

２．６利用優(yōu)化的培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)雷帕霉素

雷帕霉素是第一個從吸水鏈霉菌中分離到的抗生素，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要價值，是目前該鏈霉菌研究中的主要研究對象。Ｈｙｇｒｏｃｉｎｓ是在分離雷帕霉素時發(fā)現(xiàn)的一種與其共結(jié)晶的淺黃色色素，兩者在一定條件下可同時產(chǎn)生。在利用優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基對Ｓ． ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ATCC 29253發(fā)酵時，ＨＰＬＣ同時也檢測到了雷帕霉素合成的變化。雷帕霉素的標準曲線如圖８，ｒ２為０．９９０ ７。

通過ＨＰＬＣ檢測了Ｓ． ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ATCC 29253在Hｙｇｒｏｃｉｎｓ初始發(fā)酵培養(yǎng)基Ｍ１、優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基Ｍ２和雷帕霉素發(fā)酵培養(yǎng)基Ｍ３中雷帕霉素的產(chǎn)量。結(jié)果（表２）表明，發(fā)酵５ｄ后，雷帕霉素的產(chǎn)量均達到最大。此時，Ｍ２中菌絲體產(chǎn)量最高，是Ｍ３的１．０３倍，是Ｍ１的１．３３倍；而Ｍ２中雷帕霉素的產(chǎn)量居中，是Ｍ３的８６％，是Ｍ１的約４倍。雖然Ｍ３仍然是最適合的雷帕霉素發(fā)酵培養(yǎng)基，但是與Ｍ１相比，Ｍ２中雷帕霉素的產(chǎn)量有著明顯的提高，增加幅度是菌絲體的約３倍。表明優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基Ｍ２除了能夠促進菌絲體生長外，還可以同時提高Ｈｙｇｒｏｃｉｎｓ和雷帕霉素的產(chǎn)量，有利于提高發(fā)酵產(chǎn)物的利用率。

３結(jié)論與討論

由單因素試驗可知，吸水鏈霉菌ＡＴＣＣ２９２５３的最適發(fā)酵ｐＨ為６．５、轉(zhuǎn)速為２５０ ｒ／ｍｉｎ、最適發(fā)酵溫度為２８ ℃。根據(jù)正交試驗及碳、氮源優(yōu)化試驗的結(jié)果，培養(yǎng)基組成為甘油20.0 mL/L，棉子餅粉30.0 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，磷酸氫二鉀1.5 g/L，氯化鈉5.0 g/L，20.0 g/L甘露醇為最佳碳源、5.0 g/L水解酪蛋白為最佳氮源。優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基可促進菌絲體生長，在明顯提高Ｈｙｇｒｏｃｉｎｓ產(chǎn)量的同時，也促進了雷帕霉素的產(chǎn)生，使雷帕霉素產(chǎn)量比Ｈｙｇｒｏｃｉｎｓ發(fā)酵培養(yǎng)基提高了約３倍。雖然與雷帕霉素專用發(fā)酵培養(yǎng)基相比，產(chǎn)量略低（后者是前者的1.17倍），但是鑒于優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基可同時提高兩種抗生素的產(chǎn)量，能夠減小成本，提高利用率，使得發(fā)酵產(chǎn)物的經(jīng)濟價值最大化。

早期的鑒別方法是將發(fā)酵液的粗提物進行薄層色譜層析后，利用強堿使其安莎鏈與苯環(huán)連接的酰胺鍵開裂而呈現(xiàn)紫色，檢測靈敏度為４ μｇ［１１］， 可以用于粗略檢測安莎類抗生素，但是存在著較多的干擾，所以ＨＰＬＣ仍然是目前檢測不同類型抗生素的主要方法。吸水鏈霉菌ATCC 29253所產(chǎn)生的多種次級代謝產(chǎn)物均表現(xiàn)出抗細菌活性，亦即該鏈霉菌的抗菌活性是多種化合物抗菌效應疊加的結(jié)果。與其他活性產(chǎn)物相比，Ｈｙｇｒｏｃｉｎｓ的抗細菌活性并不算很強，利用生物活性測定的方法可能無法檢測出其代謝的變化情況。在Ｈｙｇｒｏｃｉｎｓ生物合成基因中斷突變株的抗細菌活性試驗中，也確實發(fā)現(xiàn)它們與野生型相比抑菌活性沒有明顯變化，說明Hｙｇｒｏｃｉｎｓ的缺失并不會使該鏈霉菌喪失抗細菌的活性。由于該鏈霉菌所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物較多，要想準確地檢測出化合物Ｈｙｇｒｏｃｉｎｓ，顯然需要使用較精密的檢測手段。試驗通過系統(tǒng)分析影響抗生素合成的各個因素，優(yōu)化了發(fā)酵條件及培養(yǎng)基，建立起小規(guī)模發(fā)酵及檢測Ｈｙｇｒｏｃｉｎｓ的方法，為未來研究Ｈｙｇｒｏｃｉｎｓ的生物合成和大規(guī)模生產(chǎn)打下了初步的研究基礎(chǔ)。

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［６］ ＣＡＩ Ｐ， ＫＯＮＧ Ｆ， ＲＵＰＰＥＮ Ｍ Ｅ， ｅｔ ａｌ． Ｈｙｇｒｏｃｉｎｓ Ａ ａｎｄ Ｂ， ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ ｍａｃｒｏｌｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ［Ｊ］． Ｊ Ｎａｔ Ｐｒｏｄ， ２００５， ６８：１７３６－１７４２．

［７］ ＷＡＬＴＥＲ Ｗ． Ａｎｓａｍｙｃｉｎｓ． Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］． Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７７，７２：２１－４９．

［８］ ＭＡＲＴＩＮ Ｊ Ｆ， ＤＥＭＡＩＮ Ａ Ｌ． Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ aｎｔｉｂｉｏｔｉｃ bｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［Ｊ］． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ，１９８０，４４：２３０－２５１

［９］ ＳＡＬＬＡＭ Ｌ Ａ Ｒ， ＥＬ－ＲＥＦＡＩ Ａ Ｆ， ＯＳＭＡＮＢ Ｍ Ｅ， ｅｔ ａｌ． Ｓｏｍｅ pｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ fａｃｔｏｒｓ aｆｆｅｃｔｉｎｇ rａｐａｍｙｃｉｎ pｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ＡＴＣＣ ２９２５３［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２０１０， ６（６）：１８８－１９４．

［１０］ ＫＵＳＣＥＲ Ｅ， ＣＯＡＴＥＳ Ｎ， ＣＨＡＬＬＩＳ Ｉ， ｅｔ ａｌ． Ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｒａｐＨ ａｎｄ ｒａｐＧ ｉｎ pｏｓｉｔｉｖｅ rｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ rａｐａｍｙｃｉｎ bｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ［Ｊ］． Ｊ Ｂａｃｔ，２００７，１８９：４７５６－４７６３．

［１１］ 劉愛明，武臨專，王以光，等． 苯安莎類抗生素的一種早期鑒別方法［Ｊ］． 中國抗生素雜志，２００８，３３（７）：４０３－４０６．