羥丙基-β-環糊精包合原花青素的研究

摘要：通過對包合條件進行摸索，研究用羥丙基－β－環糊精（ＨＰ－β－ＣＤ）包合原花青素的工藝，并對包合效果進行研究。結果表明，用溶液攪拌法對原花青素進行包合效果較好；單因素試驗結果表明，投料質量比（原花青素和ＨＰ－β－ＣＤ包合材料的質量比）、乙醇體積分數、反應溫度、反應時間分別為１∶４、50%、60 ℃、1.5 ｈ時，ＨＰ－β－ＣＤ包合原花青素的效果較好；通過正交試驗，確定最佳包合工藝為投料質量比１∶４，乙醇體積分數５０％，反應時間１．５ ｈ，溫度６０ ℃，此時包合效果最好，包合率為３４．14％。初步證明原花青素與ＨＰ－β－ＣＤ形成了包合物，且ＨＰ－β－ＣＤ對藥物有較好的增溶作用。

關鍵詞：原花青素；羥丙基－β－環糊精；包合；正交試驗

中圖分類號：Ｑ９４６文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）22－4701-04

Research on the Inclusion of Procyanidins by Hydroxypropyl-β-cyclodextrins

ＸＵ Ｙａ－ｗｅｉ，ＤＯＮＧ Ｃｈａｎｇ－ｙｉｎｇ，ＭＡ Ｘｉｎ－ｙｕｅ，ＹＵ Ｘｉａｏ－ｍｉｎｇ

（Ｊｉｌｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｊｉｌｉｎ １３２１０１，Ｊｉｌｉｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｏｆ ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ ｗｉｔｈ ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ－ β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｗａｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ． Ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔｓ ｏｆ ｒｅａｃｔａｎｔ ｒａｔｉｏ， ｅｔｈａｎｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｆ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｉｘｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｗｅｒｅ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｄ． Ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｗａｓ ｒｅａｃｔａｎｔ ｒａｔｉｏ， １∶４； Eｔｈａｎｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ５０％； Rｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， １．５ ｈ； Aｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ６０℃． Ｔｈｅ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｒａｔｅ ｕｎｄｅｒ ｔｈｉｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗａｓ ３４．14％． Ｉｔ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙ ｐｒｏｖｅｄ ｔｈｅ ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ－β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ； Aｎｄ ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ－β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｈａｓ ｓｏｌｕｂｌｉｚａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ； ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ－β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ； ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ； ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ

原花青素是一種有著特殊分子結構的生物類黃酮，是近年來不斷研究開發的一種較強的體內活性功能因子［１］。許多研究［２－４］表明，原花青素具有較強的抗氧化性、清除自由基能力和多種藥理活性，是目前國際上公認的清除人體內自由基最有效的天然抗氧化劑［５］。它不僅能夠防治因自由基而引起的多種疾病，還有保護血管，預防高血壓，抗腫瘤，抗輻射及美容等作用［６］。其在臨床醫學、化妝品等領域得到了廣泛的應用［７］。原花青素同其他天然色素一樣無毒副作用，安全性高，但是其仍然存在一些缺陷，如其對ｐＨ、溫度、光照等十分敏感［８］，所以若想對其有更好的利用需對其進行進一步的研究。

羥丙基－β－環糊精（Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ－β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ，ＨＰ－β－ＣＤ）是β－環糊精（β－ＣＤ）中葡萄糖殘基的２、３和６位羥基中的氫原子被羥丙基取代變成羥丙氧基。ＨＰ－β－ＣＤ不但與β－ＣＤ一樣對許多化合物具有優良的包合作用，可提高被包合物質的溶解性和穩定性［９］，而且還具有透皮吸收促進作用，有利于藥物的透皮吸收和更好地發揮治療作用。另外ＨＰ－β－ＣＤ作為一種無毒副作用的藥物輔料，已經有很多作為包合材料方面的應用實例［１０］。但國內外關于ＨＰ－β－ＣＤ對原花青素的包合研究的報道較少。因此，該研究以包合率為指標、ＨＰ－β－ＣＤ為包合材料，采用溶液攪拌法，對原花青素進行包合，研究最佳的包合工藝，為原花青素的研究提供一些理論依據。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１原料羥丙基－β－環糊精（上海伯奧生物科技有限公司）；原花青素標準品（天津尖峰天然產物研究開發有限公司）。

１．１．２試劑無水乙醇（ＡＲ級）、丙酮（ＡＲ級）、石油醚（ＡＲ級）、乙酸乙酯（ＡＲ級）等。

１．１．３儀器ＣＪ－８８１磁力加熱攪拌器（上海市南匯電訊器材廠）；ＫＱ２２００Ｅ超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Ｖ－１７００紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；ＪＡ１２０３Ｎ電子分析天平（上海精密科學儀器有限公司）等。

１．２方法

１．２．１標準曲線的繪制原花青素在５００ ｎｍ處有最大吸收，以５０％（體積分數，下同）的乙醇溶液為溶劑，分別配制濃度為１．０、２．５、１０．０、２０．０、２５．０ μｇ／ｍＬ的原花青素溶液，在５００ ｎｍ處測得吸光度分別為０．０２４、０．０２８、０．０４０、０．０５９、０．０６９，以原花青素溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標作標準曲線，得其回歸方程為＝０．００１ ８ｘ＋０．０２２ ４（ｒ＝０．９９８ ６）。

1.2．２包合方法按投料質量比１∶４準確稱量原花青素和ＨＰ－β－ＣＤ各３份，分別用溶液攪拌法、超聲法、研磨法制備包合物，然后分別稱量３種包合方法制得的包合物，計算包合率，公式為：包合物包合率＝包合物中原花青素質量／投入的原花青素質量×１００％［１１］。

１）溶液攪拌法，也叫沉淀法。首先將ＨＰ－β－ＣＤ與水加溫制成飽和溶液，然后將水溶性藥物直接加入此飽和溶液中，如為難溶于水的藥物，可先將其溶于少量有機溶媒中，再注入ＨＰ－β－ＣＤ飽和溶液中，充分攪拌，直至完全形成包合物，濃縮冷凍干燥即得［１２，１３］。文獻報道此法效果最好。該研究將原花青素用少量５０％乙醇溶解，在不斷攪拌下緩慢滴入ＨＰ－β－ＣＤ水溶液中，在室溫下攪拌１ ｈ，用旋轉蒸發儀濃縮溶液至１０ ｍＬ，濃縮液冷凍干燥即得包合物，計算包合率。

２）超聲法。ＨＰ－β－ＣＤ飽和水溶液中加入分子藥物，混合后立即用超聲波破碎儀或超聲波清洗儀，選擇適當強度，超聲適當時間，代替攪拌力，將析出的沉淀制成包合物，此方法簡便、快捷［１４］。該研究先將ＨＰ－β－ＣＤ溶于相應濃度水溶液中，超聲的同時精確稱量原花青素，用少量乙醇溶解，逐滴緩慢加入ＨＰ－β－ＣＤ溶液中，室溫下超聲１ ｈ，用旋轉蒸發儀濃縮溶液至約１０ ｍＬ，濃縮液經冷凍干燥即得包合物，計算包合率。

３）研磨法。在ＨＰ－β－ＣＤ中加２～５倍質量的水（必要時用有機溶媒），再加入藥物，充分研磨混合，約２～５ ｈ逐漸黏稠成糊狀，干燥后即得包合物。此方法特點是高效、包合率高，并適合大規模生產［１５］。該研究將ＨＰ－β－ＣＤ用適量去離子水溶解后研成糊狀，用少量乙醇溶解原花青素，加入上述糊狀物中，充分研磨１ ｈ，揮去乙醇后，糊狀物變成半固體，將此物抽濾，濾餅烘干即得包合物，計算包合率。

１．２．３單因素試驗根據資料表明，投料比、乙醇體積分數、反應時間、反應溫度對包合效果的影響最為顯著［１２］。該研究采用這４個因素進行單因素試驗，探究各個單因素的影響。

１）投料質量比對包合效果的影響。投料質量比分別為１∶１、１∶２、１∶４、１∶６、１∶８，在乙醇體積分數為５０％，反應溫度為６０ ℃，反應時間為１.0 ｈ的條件下反應，計算包合率。

２）乙醇體積分數對包合效果的影響。乙醇體積分數分別為３０％、４０％、５０％、６０％、７０％，在投料質量比為１∶４，反應溫度為６０ ℃，反應時間為１．０ ｈ的條件下進行反應，計算包合率。

３）反應時間對包合效果的影響。反應時間分別為０．５、１．０、１．５、２．０、２．５ ｈ，在投料質量比為１∶４，反應溫度為６０ ℃，乙醇體積分數為５０％的條件下反應，計算包合率。

４）反應溫度對包合效果的影響。反應溫度分別為３０、４０、５０、６０、７０、８０ ℃，在投料質量比為１∶４，乙醇體積分數為５０％，反應時間為１．５ ｈ的條件下反應，計算包合率。

１．２．４正交試驗采用磁力攪拌法，選擇４個因素（投料質量比、乙醇體積分數、反應時間、反應溫度），每個因素３個水平，以包合率作為考察指標，采用Ｌ９（３４）正交試驗［１６］計算包合率，得出最佳包合工藝。

１．２．５包合物的制備在正交試驗所得的最佳工藝條件下，用ＨＰ－β－ＣＤ對原花青素進行包合，計算包合率。

２結果與分析

２．１包合方法的確定

如表１可知，溶液攪拌法的包合率最高，為３３．９８％，因此此方法包合效果最好，該研究用溶液攪拌法進行試驗研究。

２．２單因素試驗結果分析

２．２．１投料質量比對包合效果的影響由圖２可知，當投料質量比值大時包合材料不足，包合率較低，故投料質量比大于１∶４時，隨著投料質量比的減小包合率逐漸增加，到１∶４時最大，小于１∶４時，由于反應液黏度增大，不利于包合反應的進行反而使包合率逐漸減小。由此可見，當投料質量比為１∶４時最為合適，故選投料質量比１∶２、１∶４、１∶６進行正交試驗。

２．２．２乙醇體積分數對包合效果的影響由圖３可知，體積分數太低的乙醇溶液不能使原花青素完全溶解，影響包合效果，故乙醇體積分數小于５０％時，隨著乙醇體積分數的提高，包合率逐漸增加，直到５０％時包合率最高，大于５０％時，乙醇體積分數增加，極性增加，破壞包合物，反而使包合率逐漸下降，由此可得出最合適的乙醇體積分數為５０％，故選乙醇體積分數４０％、５０％、６０％進行正交試驗。

２．２．３反應時間對包合效果的影響由圖４可知，當反應時間太短時，原花青素沒有完全反應，故反應時間小于１．５ ｈ時，隨著反應時間的延長，包合率逐漸增加，直到反應１．５ ｈ時包合率最高，當反應時間繼續延長時原花青素的穩定性差，擴散阻力減小，包合率下降，故大于１．５ ｈ時包合率又逐漸下降，綜上所述，當反應時間為１．５ ｈ時包合率效果最好，故選反應時間１．０、１．５、２．０ ｈ進行正交試驗。

２．２．４反應溫度對包合效果的影響由圖５可知，當反應溫度較小時反應物的分子運動較慢，故反應溫度小于６０ ℃時，隨著反應溫度的升高，包合率逐漸增加，在反應溫度為６０ ℃時包合率最高，反應溫度過高可以加速分子的運動速度，分子的穩定性降低，并且反應溫度過高將增加分子外層親水基團對其疏水基團的排斥力，使包合過程不易進行，從而當反應溫度大于６０ ℃，隨著反應溫度的升高，包合率反而下降。綜上所述當反應溫度為６０ ℃時包合率最高，包合效果最好，故選反應溫度５０、６０、７０ ℃進行正交試驗。

２．３正交試驗結果分析

采用磁力攪拌法，選擇４個因素（投料質量比、乙醇體積分數、反應時間、反應溫度），每個因素３個水平，以包合率作為考察指標，采用Ｌ９（３４）正交表設計正交試驗，正交試驗因素與水平見表２，正交試驗結果見表３。

由表３可以看出，用磁力攪拌法對ＨＰ－β－ＣＤ包合原花青素的工藝條件進行優化時發現影響包合率的因素Ａ＞Ｂ＞Ｄ＞Ｃ，理論上最佳工藝條件為Ａ２Ｂ２Ｃ３Ｄ２，即投料質量比１∶４，乙醇體積分數５０％，反應時間２．０ ｈ，反應溫度６０ ℃。但是工業生產上為了節省時間和成本，應選擇最佳工藝為投料質量比１∶４、乙醇體積分數５０％，反應時間１．５ ｈ、反應溫度６０ ℃。此組合為ＨＰ－β－ＣＤ包合原花青素的最佳工藝條件。按選擇的包合條件制備了一批包合物，計算得包合率達３４．14％。按照此工藝條件制備了３批樣品，結果所制得的包合物在室溫靜置３周后溶液仍澄清。而原花青素水溶液在同樣條件下放置后不久溶液就出現渾濁，初步證明包合物溶液較為穩定。

３結論

由包合方法的選擇試驗結果得到溶液攪拌法的包合效果最好。由單因素試驗和正交試驗的結果，結合實際情況得到在工業生產時投料質量比１∶４、乙醇體積分數５０％、反應時間１．５ ｈ、反應溫度６０℃的包合效果較好，此條件為羥丙基－β－環糊精（ＨＰ－β－ＣＤ）包合原花青素的最佳工藝條件，此條件下所得的包合率為３４．14％。該研究為提高原花青素的應用價值及ＨＰ－β－ＣＤ作為包合物提供了一定的理論依據，從而使原花青素和ＨＰ－β－ＣＤ能更好地被人類使用。

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