蘇云金桿菌以色列亞種L-10菌株培養基優化研究

摘要：利用單因素篩選和正交試驗，對蘇云金桿菌以色列亞種Bti-Ｌ－１０高毒菌株的發酵培養基進行了優化，得到其最佳培養基配方為：淀粉３％，氮源Ｂ ０．５0％，氮源Ｃ ０．７５％，氮源Ｄ ４．０0％，氮源Ｇ １．０0％。通過２００ Ｌ和４０ ０００ Ｌ發酵罐分別發酵，發酵液效價分別為３７９ ＩＴＵ／ｍｇ和３２７ ＩＴＵ／ｍｇ，發酵液經過后處理，所得原粉效價分別為８ ９２８ ＩＴＵ／ｍｇ和６ ８３７ ＩＴＵ／ｍｇ。

關鍵詞：蘇云金桿菌以色列亞種；培養基；優化

中圖分類號：S482.3+9；TQ453.5 文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）22－4603-03

Ｓｔｕｄy ｏｎ ｔｈｅ Ｍｅｄｉａ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． iｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ Ｓｔｒａｉｎ

ＬＩＵ Ｆａｎｇ，ＬＩＡＯ Ｘｉａｎ－ｑｉｎｇ，ＺＨＯＵ Ｒｏｎｇ－ｈｕａ，ＺＨＡＮＧ Ｚｈｉ－ｇａｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｚｕｎ－ｘｉａ

（Ｈｕｂｅｉ Ｂｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｗｕｈａｎ ４３００６４，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ｔｏｘｉｃ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ Bti-Ｌ－１０ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔｓ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｆｏｒｍｕｌａ ｏｆ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ ３．０％ ｓｔａｒｃｈ＋０．５0％ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ Ｂ＋０．７５％ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ Ｃ ＋ ４．０0％ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ Ｄ＋１．０0％ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ Ｇ． Ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｏｏｋ ｐｌａｃｅ ｉｎ ２００ Ｌ ａｎｄ ４０ ０００ Ｌ ｆｅｒｍｅｎｔｏｒｓ； ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ ｗａｓ ３７９ ａｎｄ ３２７ ＩＴＵ／ｍｇ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｐｏｗｄｅｒ ｗａｓ ｍａｄｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｏｗｎ－ｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ， ａｎｄ ｗｉｔｈ ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ８ ９２８ ａｎｄ ６ ８３７ ＩＴＵ／ｍｇ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄs： Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ； ｍｅｄｉｕｍ； ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ

蚊類不僅吸血騷擾，而且是多種嚴重疾病，如瘧疾、絲蟲病、黃熱病及登革熱等的傳播媒介［１，２］，化學合成殺蟲劑已成為防治蚊類的主要手段。隨著化學殺蟲劑的過度和廣泛使用，蚊類抗藥性不斷增強，同時也造成環境污染［３］。蘇云金桿菌以色列亞種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． Ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ，簡稱Ｂｔｉ）由Ｇｏｌｄｂｅｒｇ和Ｍａｒｇａｌｉｔ于１９７７年發現［４］，已廣泛用于蚊蠅幼蟲防治，其優點在于可控制１～４齡幼蟲，施后見效快（４～２４ ｈ）持效長（７～３０ ｄ），適用于除飲用水外各種水體（包括澆灌水）的蚊類防治，在水體中可自然分解，無污染，不影響非目標生物，對施藥者、野生動物及家畜無副作用［５］。湖北省生物農藥工程中心菌種室分離到一株對蚊類幼孑孓高毒的Ｂｔｉ－Ｌ－１０菌株，該試驗對該菌株培養基進行了優化研究。

１材料與方法

１．１菌株和培養

Ｂｔｉ－Ｌ－１０菌株為湖北省生物農藥工程研究中心菌種室分離篩選并保藏；斜面活化培養基為牛肉膏蛋白胨培養基；單因素篩選碳源固定為玉米淀粉，氮源為７種市售農副產品（代號：A、B、C、D、E、F、G）。將菌株接種至牛肉膏蛋白胨斜面培養基，于３０ ℃培養９６ ｈ備用。

１．２方法

１．２．１單因素篩選固定玉米淀粉作碳源，用量１％；分取７種市售農副產品作氮源，用量３％。滅菌前調ｐＨ值至７．５，分裝于５００ ｍＬ三角瓶，每瓶５０ ｍＬ，0.1 MＰａ滅菌３０ ｍｉｎ。挑取１環菌苔接種于搖瓶中，旋轉式搖床振蕩培養，溫度３０～３２ ℃，轉速２２０ ｒ／ｍｉｎ，培養至芽孢和晶體４０％分離時下搖床，鏡檢和生物測定發酵液［６］。

１．２．２正交試驗固定玉米淀粉用量３％，選取Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｇ作氮源，四因素三水平正交試驗（表１）。固定碳酸鈣０．１％，硫酸鎂０．０３％，磷酸二氫鉀０．０１％，按表１各濃度要求配制培養基，滅菌前調ｐＨ值至７．５，分裝于５００ ｍＬ三角瓶，每瓶裝量２５ ｍＬ。滅菌、培養同１．２．１，鏡檢和生物測定發酵液。

１．２．３２００ Ｌ發酵罐發酵按正交試驗篩選到最佳培養基組分配制好培養基，投料體積１２０ Ｌ，消泡劑０．２％，滅菌前調ｐＨ值至７．５，0.1MＰａ滅菌３０ ｍｉｎ，溫度降至３２ ℃時接入經８０ ℃水浴２０ ｍｉｎ的孢子懸浮液，通氣比１∶０．５～１．２，罐壓0.05MＰａ，培養溫度３０～３２ ℃，芽孢和晶體４０％分離時結束發酵。將發酵液ｐＨ值調至４．５，過１００目篩，臺式離心機離心，３倍濃縮，所得菌漿冷凍干燥得原粉，測定發酵液和凍干粉的效價。

１．２．４４０ ０００ Ｌ發酵罐發酵按正交試驗篩選到最佳培養基組分配制好培養基，投料體積２７ ０００ Ｌ，消泡劑０．１％，滅菌前調pＨ值為７．５，0.１MＰａ滅菌３０ ｍｉｎ。待溫度降至３２ ℃時接入經８０ ℃水浴２０ ｍｉｎ的孢子懸浮液，通氣比１∶０．５～１．０，罐壓0.05MＰａ，培養溫度３０～３２ ℃，攪拌常開，發酵過程中取樣鏡檢，芽孢和晶體４０％分離時結束發酵。將發酵液ｐＨ值調至４．５，過１００目篩，碟片式離心機離心，３倍濃縮后的菌漿經高速離心式噴霧干燥機進行噴霧干燥，得到原粉，測定發酵液和原粉的效價。

１．２．５生物測定供試蟲為白紋伊蚊４齡幼蟲，參照參考文獻［７］進行測定。

２結果與分析

２．１單因素篩選

Ｂｔｉ－Ｌ－１０菌株在不同的氮源培養基中搖瓶發酵結果如表２。從表２可以看中，氮源Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｇ均能被較好利用，其中氮源Ｄ同步率最高，菌體形態好，氮源Ｇ其次，氮源Ｂ、Ｃ同步率７０％，菌體碎小，氮源Ａ，Ｅ，Ｆ利用能力差，鏡檢見極少量菌體。據此結果，選Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｇ作進一步試驗的氮源物質。

２．２正交試驗

固定碳源為玉米淀粉，氮源Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｇ的Ｌ９（３４）正交試驗結果如表３和表４。

從表３和表４分析結果表明，這４種氮源主效應排序為Ｂ＞Ｃ＞Ｄ＞Ｇ。氮源Ｂ的Ｆ值為２．８８６，對發酵的影響大，而氮源Ｄ、Ｇ對發酵的影響不是很大。確定最佳配方為淀粉３％，氮源Ｂ ０．５０％，氮源Ｃ ０．７５％，氮源Ｄ ４．００％，氮源Ｇ １．００％，碳酸鈣０．１％，硫酸鎂０．０３％，磷酸二氫鉀０．０１％。

２．３２００ Ｌ發酵罐發酵

發酵周期３０ ｈ，發酵２４ ｈ取樣鏡檢，孢囊形成率為９８％，菌體大小整齊。放罐時取樣鏡檢，晶體５０％左右脫落，晶體圓形，大小一致。將發酵液和冷凍干燥粉進行生物測定，發酵液效價３７９ ＩＴＵ／ｍｇ，冷凍干燥粉效價８ ９２８ ＩＴＵ／ｍｇ。

２．４４０ ０００ Ｌ發酵罐發酵

分別于２０１０年３月和２０１１年３月在湖北康欣農用藥業有限公司車間共進行３批次大罐發酵，離心濃縮，噴霧干燥得到原粉。分別對這三批發酵液和原粉取樣進行生物測定，結果見表５。

３小結與討論

通過單因素氮源篩選和正交試驗，獲得Ｂｔｉ－Ｌ－１０菌株最佳培養基配方為淀粉３％，氮源Ｂ ０．５０％，氮源Ｃ ０．７５％，氮源Ｄ ４．００％，氮源Ｇ １．００％，碳酸鈣０．１％，硫酸鎂０．０３％，磷酸二氫鉀０．０１％。采用該配方進行了２００ Ｌ和４０ ０００ Ｌ發酵罐試驗，發酵液效價和原粉效價均達到較高水平。但２００ Ｌ和

４０ ０００ Ｌ發酵罐的發酵水平還是存在差異，估計與發酵過程中中間控制工藝包括培養溫度、通氣量、攪拌轉速以及后處理過程中的濃縮和干燥方法等有關。

Ｂｔ制劑產品的質量優劣取決于多方面的因素。如高毒力菌株、最佳發酵培養基配方、發酵中間控制工藝和后處理工藝技術。目前國內比較重視高毒力菌株的構建篩選和最佳發酵培養基配方篩選，而對發酵中間控制工藝和后處理工藝技術的優化研究開展不夠，擬對該菌株的發酵工藝和后處理工藝開展進一步的研究。

參考文獻：

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［７］ 陳在佴，吳繼星，張志剛． 蘇云金桿菌９９－１１菌株培養條件的研究［Ｊ］． 湖北農業科學，２００５（６）：３９－４１．