外加光合細菌對養殖水體水質及微生物群落的影響

2011-12-31 00:00:00熊暉梁運祥

湖北農業科學 2011年22期

摘要：以自行設計的養殖水體微宇宙模型為基礎，研究不同濃度下外加光合細菌對養殖水體的影響，結果表明，該菌株能明顯有效地去除養殖水體微宇宙模型中積累的ＮＯ２－、ＮＯ３－、ＣＯＤＭｎ，濃度為１０４ＣＦＵ／ｍＬ時ＮＯ２－、ＮＯ３－的去除率分別達到５８．４％和８９．６％，為最佳投菌濃度。此外，用ＰＣＲ－ＤＧＧＥ的方法驗證了用光合細菌治理養殖水體污染的同時還能有效地增加養殖水體中微生物群落的豐富度，是一種安全有效的微生態菌劑。

關鍵詞：微宇宙；光合細菌；養殖水體；種群多樣性

中圖分類號：Ｑ９３９．９６文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）22－4682-04

Study on the Impact of External Photosynthetic Bacteria on Water Quality and Microbial Community of Aquaculture Water

ＸＩＯＮＧＨｕｉ，ＬＩＡＮＧＹｕｎ－ｘｉａｎｇ

（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＨｕａｚｈｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ４３００７０，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Based on the aquaculture water model designed， the effects ofphotosynthetic bacteria with different ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎａｑｕａｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｅｂａｃｔｅｒｉａｃｏｕｌｄｄｅｃｒｅａｓｅｔｈｅａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄＮＯ２－、ＮＯ３－ａｎｄＣＯＤＭｎｉｎｗａｔｅｒ．Ｗｈｅｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｂａｃｉｌｌｉｗａｓ１０４ＣＦＵ／ｍＬ，ｔｈｅｒｅｍｏｖａｌｒａｔｅｏｆＮＯ２－ａｎｄＮＯ３－ｒｅａｃｈｅｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔ，５８．４％ａｎｄ８９．６％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｉｔｗａｓｖｅｒｉｆｉｅｄｔｈａｔｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａｗｅｒｅｓａｆｅａｎｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｍｉｃｒｏｂｉａｌａｇｅｎｔｓａｓｔｈｅｙｃｏｕｌｄｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｒｉｃｈｎｅｓｓａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅＰＣＲ－ＤＧＧＥｍｅｔｈｏｄ.

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｍｉｃｒｏｃｏｓｍ；ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａ；ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅｗａｔｅｒ；ｃｏｍｍｕｎｉｔｙｄｉｖｅｒｓｉｔｙ

隨著水產養殖業的迅速發展，工廠化高密度養殖的規模日益擴大，養殖密度過大，養殖品種單一，養殖生態環境失調，造成大面積養殖生態系統的破壞，從而引發各種病害。養殖水體的污染治理問題亟待解決。益生菌作為一類微生態制劑能改善養殖生態環境，能提高養殖動物的免疫力，減少其疾病的發生，最終以可持續發展的方式提高經濟效益［１－４］。

光合細菌（Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａ，簡稱ＰＳＢ）是一類以光為能源，以自然界中有機物、硫化物等為營養，并能進行光合作用的微生物［５］。它不僅能凈化水質［６］，而且含有豐富的營養，可作為魚蝦的餌料添加劑［７，８］，是被廣泛運用的微生態制劑之一。

對于外加微生物菌劑是否會因為改變水體中菌群結構而造成潛在生態環境威脅，目前國內尚無文獻報道來提供直接證據。研究旨在利用實驗室條件下的養殖水體微宇宙模型模擬養殖周期內水質變化過程，通過不同濃度的投菌試驗尋找經濟有效的投加濃度；同時，利用現代分子生物學分析手段，驗證作為外加微生態制劑的光合細菌是否會給養殖生態系統帶來物種豐富度降低的風險，研究其對微生物群落豐富度的具體影響。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１供試菌株菌株沼澤紅假單胞菌（Ｒｈｏｄｏｐｈｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐａｌｕｓｔｒｉｓ）由華中農業大學生命科學技術學院發酵工程實驗室保藏。

１．１．２微宇宙水體參考經典微宇宙［９］的構建要素，以忠實于實際養殖水體整體環境為前提，綜合考慮試驗取樣及操作的便利性與可重復性，自行設計了如下養殖水體微宇宙模型。

１．２方法

１．２．１水質分析方法水質分析項目包括ｐＨ、總氮（ＴＮ）、銨氮（Ｎ－ＮＨ４＋）、硝酸鹽（ＮＯ３－）、亞硝酸鹽（ＮＯ２－）、高錳酸鹽指數（ＣＯＤＭｎ）、總磷（ＴＰ）、可溶性有機磷（ＳＯＰ）。具體方法參考中華人民共和國國家水質指標測定法［１０］。

１．２．２微生物種群豐富度研究方法分子生物技術的各類方法已被廣泛應用于環境微生物種群結構的研究，其中變性梯度凝膠電泳技術（ＰＣＲ－ＤＧＧＥ）是目前可以探知最為完整菌群結構的方法之一［１１］。采用ＰＣＲ－ＤＧＧＥ的方法研究光合細菌對水體的影響。考慮到試驗目的在于研究微生物種群豐富度，要求ＤＧＧＥ電泳結果分辨率高并且條帶豐富，因此ＰＣＲ擴增引物采用９６８ｆ／１４０１ｒ［１２］，擴增片段為ＤＮＡ的１６ＳｒＤＮＡＶ６～Ｖ８區段，長度約為４６９ｂｐ。ＤＧＧＥ電泳變性膠濃度范圍３０％～７０％，采用銀染法進行染色。經過溫度梯度ＰＣＲ確定ＰＣＲ退火溫度為６１ ℃。ＤＧＧＥ電泳膠的圖像采用ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ分析條帶。微生物種群豐富度采用Ｓｈａｎｎｏｎ－Ｗｉｅｎｅｒ［１３］公式測定，具體計算公式為：Ｈ′＝－∑ＰｉｌｎＰｉ，式中，Ｈ′為微生物多樣性指數，Ｐｉ為第ｉ種的個體數與總個體數的比值。用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＯｆｆｉｃｅＥｘｃｅｌ軟件來輔助計算多樣性指數。

１．２．３試驗設計按照表１條件設立３個不同投菌濃度的試驗組（試驗組１、２、３分別按照投菌濃度１０４、１０５、１０６ＣＦＵ／ｍＬ投加光合細菌培養液）及對照組，投菌及添加魚飼料的頻率為2 d一次。每次取樣５００ｍＬ，按照表２方法檢測8項水質指標，另取１６０ｍＬ水樣用于水體微生物基因組ＤＮＡ的提取，注意在投加菌液和飼料前將水補齊至標線。

２結果與分析

２．１外加光合細菌對水質指標的影響

試驗組１、２、３從試驗第１２天開始投菌，如圖中箭頭所示，設立不投菌的空白對照組ＣＫ，以觀察相對ＣＫ外加菌劑對指標的影響。圖１顯示了氮素各指標在這株光合細菌作用下的變化曲線。圖１a顯示３個試驗組和對照（ＣＫ）的ＴＮ均持續增加，將各變化曲線進行二次函數擬合，比較其斜率發現，３個試驗組都高于ＣＫ。其中試驗組１、２、３的增幅分別超過ＣＫ的１４．２％、９．２％、１８．７％。圖１b顯示投菌后N-ＮＨ４＋曲線先升后降，投菌濃度最低的試驗組1的N-ＮＨ４＋濃度比試驗組2和3都要高，說明較高投菌濃度下該菌有降低N-ＮＨ４＋的作用。ＮＯ３－的變化曲線顯示（圖１c），試驗組１的１０４ＣＦＵ／ｍＬ投菌濃度下ＮＯ３－濃度可低于同期ＣＫ的８９．６％，是試驗中獲得的最高ＮＯ３－去除率。圖１d顯示，各試驗組的ＮＯ２－終濃度均低于ＣＫ，以ＣＫ的ＮＯ２－終濃度為標準，３個試驗組對ＮＯ２－的去除率分別達到了５８．４％、１４．０％、９．４％。由此可見，當投菌濃度為１０４ＣＦＵ／ｍＬ時ＮＯ２－和ＮＯ３－的去除率均達到最高值，又由于ＮＯ２－是養殖水體水質的關鍵性指標，故其可視為本試驗條件下的最適投菌濃度。

試驗由第１２天開始投菌，如箭頭所示。由圖２a中試驗組１的曲線可知，該菌株在投菌后的６ d（即試驗第１２～１８天）內能明顯降低ＴＰ，而后ＴＰ上升。ＳＯＰ的曲線（圖２b）表明，只有在投菌濃度為１０４ＣＦＵ／ｍＬ時，持續投菌６ d內（即試驗第１２～１８天）能降低水體中ＳＯＰ的含量。從圖３a可見，同樣以ＣＫ為參照，試驗結束時，試驗組１、２、３的ＣＯＤＭｎ分別降低了１９．１％、３２．２％、６．０％。從圖３b可見，對ｐＨ的影響不大，即使在高投菌濃度下也能保證水體中的ｐＨ在７．０與７．６之間波動。

２．２外加光合細菌對水體中微生物群落豐富度的影響

以最適濃度１０４ＣＦＵ／ｍＬ為條件，設置３個平行試驗組，對光合細菌影響水體微生物群落的結果進行分析，由于３組試驗的PCR-ＤＧＧＥ電泳圖結果相似，以試驗組１為例說明結果。在第５次取樣即第５天后，開始向試驗組１投加光合細菌。對比ＣＫ和試驗組１的PCR-ＤＧＧＥ電泳圖上的條帶數目變化（圖４、圖５），試驗開始時，條帶均為６，在投加菌劑后，第２組條帶數目都有所增加。試驗結束時，ＣＫ條帶數目為１２，試驗組１的條帶數則達到３０，是前者的２．５倍。即投加光合細菌后，使得水體中微生物種類達到了自然條件下的２．５倍，明顯增加了種類豐富度。

以上是直觀地從微生物種類數量上分析的結果。若將微生物量的變化考慮在內，以ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ軟件分析PCR-ＤＧＧＥ電泳圖后報告的條帶相對峰值為統計對象，計算多樣性指數Ｈ′并分析結果如圖６所示，結果表明加入光合細菌能明顯提高水體中微生物的多樣性，且具有持續性。

３小結與討論

利用養殖水體微宇宙模型，針對實驗室分離獲得的一株光合細菌進行了試驗。試驗結果表明，這株光合細菌具有明顯降低亞硝酸鹽（ＮＯ２－）、硝酸鹽（ＮＯ３－）和ＣＯＤＭｎ的作用。對比３個投菌濃度的試驗結果，１０４ＣＦＵ／ｍＬ的投菌濃度下能使得ＮＯ２－和ＮＯ３－的去除率分別達到５８．４％和８９．６％，為最適投菌濃度。投加光合細菌后３個濃度試驗組中的N-ＮＨ４＋都呈現先上升后下降的變化趨勢，這與類似試驗研究結果相同，如吳偉［１４］認為，這是因為其本身是活菌制劑，隨著菌體包括培養基的導入，有機質含量相應會有所增加，并且由于伴隨著菌體的代謝降解，N-ＮＨ４＋會先上升。該菌有一定的降低ＣＯＤＭｎ的能力。它對于水體磷素的去除作用僅表現在前６ d，繼續投加反而會使水體磷素增加。另外，還考察了最適投菌濃度下該光合細菌對水體中微生物群落豐富度的影響。對比條帶數目以及多樣性指數Ｈ′的變化趨勢，向水體投加光合細菌能夠從種類和數量上大幅增加微生物群落豐富度，能使微生物的種數達到原水體自然情況下的２．５倍。說明外加光合細菌有助于增強水體自身抵抗不良環境的能力，幫助養殖水體增強自凈功能。

在水產養殖業中，水體中ＮＯ２－以及N-ＮＨ４＋的濃度過高會引起魚、蝦等致病，是影響產量的主要因素［１５］。這株光合細菌和國內外報道的大部分從自然條件下篩選分離的光合細菌一樣，具有明顯降低ＮＯ２－、N-ＮＨ４＋以及ＣＯＤＭｎ的能力。但是，光合細菌在不同環境條件以及底物濃度下的處理效率差別較大，如光照強度作為單一變量時，N-ＮＨ４＋的去除率就可在２０．５８％和７０．４５％間變化［１６］。由于養殖水體屬于人工生境，這個特殊條件下各物質不同濃度對氮磷去除率的影響還有待進一步研究。

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