酶法預處理苧麻葉提取總酚酸的工藝優化

摘要：為開發和利用苧麻資源，采用酶法對苧麻葉總酚酸的提取工藝進行了研究。用纖維素酶對苧麻葉進行預處理，以單因素試驗為基礎，對總酚酸提取率進行正交設計，用福林－酚比色法于７５５ ｎｍ波長處測定總酚酸含量。結果表明，酶解時ｐＨ值為５．０，酶解后在料液比為１∶２０（Ｗ／Ｖ，ｇ∶ｍＬ）、溫度為7０℃、提取時間為2.0 ｈ、提取２次、乙醇體積分數為７０％條件下，苧麻葉總酚酸的最佳提取率為０．０５０％。影響提取率４個因素主次順序為提取時間＞料液比＞ｐＨ值＞溫度。該工藝提取率高、步驟簡單、成本較低，適合于苧麻葉中總酚酸的工業化提取。

關鍵詞：苧麻；總酚酸；單因素試驗；正交設計

中圖分類號：S563.1；R284.2文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）10－2105-03

Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｏｔａｌ Ｐｈｅｎｏｌｉｃ Ａｃｉｄ ｆｒｏｍ Ｂｏｅｈｍｅｒｉａ ｎｉｖｅａ

ｂｙ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ

ＬＩＵ Ｚｈａｏ－ｘｉａ，ＺＯＵ Ｋｕｎ，ＺＨＯＵ Ｙｕａｎ，ＬＥＩ Ｘｉａｏ－ｙａｎ

（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ Ｈｕｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ／Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，

Ｃｈｉｎａ Ｔｈｒｅｅ Ｇｏｒｇｅｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｙｉｃｈａｎｇ ４４３００２， Ｈｕｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｍａｋｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ｕｓｅ ｏｆ Ｂｏｅｈｍｅｒｉａ ｎｉｖｅａ， ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ． Ａｆｔｅｒ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｂｙ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｅｎｚｙｍｅ， ｔｈｅ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ ｗａｓ ａｄｏｐｔｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔ ｔｏ ｃｈｅｃｋ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｆａｃｔｏｒｓ． Ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ａｔ ７５５ ｎｍ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｐＨ ５．０， ｓｏｌｉｄ ｔｏ ７０％ ｅｔｈａｎｏｌ ｒａｔｉｏ １∶２０（Ｗ／Ｖ， ｇ∶ｍＬ）， ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｆｏｒ １ ｈ ａｔ ５０ ℃ ｔｗｉｃｅ． Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗａｓ ０．０５0％， ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ３５．５％ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｎｏｎ－ｅｎｚｙｍｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ． Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｔｏ ｃｏｍｍｏｎ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ＞ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｓａｍｐｌｅ ｔｏ ｓｏｌｖｅｎｔ ＞ ｐＨ ＞ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ． Ｂｙ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ， ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｗａｓ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ waｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂｏｅｈｍｅｒｉａ ｎｉｖｅａ； ｔｏｔａｌ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ； ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔ； ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ

苧麻（Ｂｏｅｈｍｅｒｉａ ｎｉｖｅａ Ｌ．）為蕁麻科苧麻屬多年生宿根性植物，苧麻根、葉藥用，在我國１６世紀就有記載。我國民間用煎劑治療感冒發燒、麻疹高熱、尿路感染、腎炎水腫、孕婦腹痛、胎動不安、先兆流產以及外科上對跌打損傷、骨折、瘡腫癰毒等均有一定療效［１］。２０世紀７０年代以來，我國醫學上對苧麻根化學成分和藥理作用曾進行過研究［２］。苧麻葉作為苧麻紡織工業的廢棄物資源極其豐富，苧麻葉片約占植株重量的４０％左右［３］。但根據已有研究資料表明，苧麻葉中含有與根相同的成分綠原酸，此外還含有原兒茶酸、野漆樹苷、蕓香苷等酚酸類等抗氧化活性物質［４］。提取藥材有效成分時，多用溶劑法浸泡藥材。植物細胞壁不溶于大部分溶劑，像屏障一樣阻礙了細胞壁內有效成分的溶出時間和溶出量。纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一類酶的總稱，能將細胞壁降解為小分子或易溶物質，并將細胞內有效成分釋放出來，加大同溶劑的接觸面積，快速提取有效成分［５］。試驗采用纖維素酶預處理苧麻葉后，對總酚酸提取工藝進行了優化，以期為苧麻葉化學成分的進一步開發利用提供科學依據。

１材料與方法

１．１材料

苧麻葉（２００９年４月采自湖北省宜昌市）；纖維素酶（安琪Ⅰ號，湖北安琪酵母股份有限公司提供）；試驗所用試劑均為分析純；ＳＰ－７５２紫外分光光度計（上海光譜儀器有限公司），ＲＥ－５２旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠），ＦＡ－Ｎ分析天平（上海精科），恒溫水浴箱（上海亞榮生化儀器廠），超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司），ＳＨ２－Ｄ３循環式真空泵（鞏義市予華儀器責任有限公司）。

１．２方法

１．２．１福林試劑的配制稱取８ ｇ鎢酸鈉和２ ｇ鉬酸鈉于圓底燒瓶中，用５６ ｍＬ去離子水溶解，加入４ ｍＬ ８５％的磷酸溶液和８ ｍＬ濃鹽酸，文火回流１０ ｈ，然后加入１．２ ｇ硫酸鋰及６ ｍＬ雙氧水，加熱沸騰１５ ｍｉｎ 至亮黃色，不得帶微藍和綠色。冷卻，移入１００ ｍＬ容量瓶中，定容，放于棕色瓶中，４℃冰箱保存。

１．２．２對照品溶液的制備準確稱取１０．００ ｍｇ沒食子酸，加去離子水適量，溶解，放至冷卻，以去離子水定容至１００ ｍＬ，制成每毫升含０．１ ｍｇ綠原酸的溶液，作為對照品溶液。

１．２．３苧麻葉總酚酸的提取方法取自然曬干的苧麻葉，剪碎。精密稱取苧麻葉碎片２ ｇ，加入１％纖維素酶２０ ｍＬ，ｐＨ值為４．８的緩沖溶液，于５０℃水浴中加熱處理苧麻葉１．０ ｈ，將酶滅活后，趁熱過濾，在濾渣中加入７０％乙醇溶液（ｐＨ值為５．０），于一定溫度、ｐＨ值條件下加熱回流一定時間，抽濾，重復１次，合并２次提取液，減壓濃縮于１０ ｍＬ容量瓶中定容，作為供試品溶液。

１．２．４總酚酸提取條件的確定試驗采用纖維素酶進行酶解后，采用單因素設計，分別考察ｐＨ值、提取溫度、提取時間、提取溶劑體積分數、提取料液比、提取次數６個因素對苧麻葉提取液中總酚酸含量的影響。

１．２．５總酚酸含量的測定

１）標準曲線的制作。精密吸取對照品溶液０、０．１０、０．２０、０．３０、０．４０、０．５０ ｍＬ于１０ ｍＬ容量瓶中，各加６ ｍＬ水，搖勻，再加０．５ ｍＬ福林試劑，充分搖勻，加入０．７５ ｍＬ ２０％碳酸鈉溶液，混勻，以去離子水稀釋至刻度。分別在４０℃下水浴４０ ｍｉｎ，于７５５ ｎｍ波長處測定吸光度。以沒食子酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得其回歸方程為＝７．６６４ ５ｘ＋０．０２８ ４，ｒ＝０．９９９ ７，線性范圍０．１～０．７ ｍｇ／ｍＬ范圍內與其吸光度呈現良好的線性關系。

２）苧麻葉總酚酸的含量測定。取１．２．３項供試品溶液０．５ ｍＬ，置于１０ ｍＬ容量瓶中，再按１．２．３項步驟操作，于７５５ ｎｍ波長處測定吸光度，計算提取率。總酚酸提取率計算公式為：總酚酸提取率＝（待測樣品中總酚酸質量×稀釋倍數／樣品重量）×１００％

２結果與分析

２．１單因素試驗

２．１．１提取溫度對總酚酸提取率的影響按１．２．３項方法加入７０％乙醇后，分別于４０、５０、６０、７０℃水浴鍋中回流１ ｈ，提取２次，測定并計算總酚酸提取率，結果見圖１。由圖１可以看出，隨著提取溫度的升高，總酚酸得率逐漸增加。在６０℃時總酚酸得率最高（０．０３５％），７０℃以后有所下降，這可能是由于溫度過高會使得活性成分被破壞，鑒于總酚酸的熱穩定性及雜質的溶出問題，對總酚酸來說，選擇提取溫度為６０℃左右較好。

２．１．２提取時間對總酚酸提取率的影響按１．２．３項方法，選取提取時間分別為０．２、０．５、１．０、２．０ ｈ。提取時間對總酚酸提取率的影響結果見圖２。圖２結果顯示，總酚酸的提取率在１．０ ｈ內達到０．０３４％，１．０ ｈ以后趨于平緩，提取率變化不大，考慮再延長提取時間不利于縮短生產周期，會增加生產成本和消耗，所以選取１．０ ｈ作為適合提取時間。

２．１．３ｐＨ值對總酚酸提取率的影響按１．２．３項方法，選取ｐＨ值分別為３．０、４．０、５．０、６．０，ｐＨ值對總酚酸提取率的影響結果見圖３。由圖３可知，隨著ｐＨ值的升高，總酚酸得率逐漸增加。在ｐＨ值為５．０時總酚酸得率最高（０．０３６％），ｐＨ值為６．０以后得率有所下降，說明ｐＨ值過高不利于總酚酸浸提的穩定性，酸度過高，酚性成分易形成烊鹽，酸度過低，總酚酸形成鹽，均不利于提取，故選擇ｐＨ值為５．０較好。

２．１．４提取次數對總酚酸提取率的影響圖４反映了提取次數對總酚酸提取率的影響，提取次數越多，總酚酸得率越大。但當提取２、３次后，得率均為０．０３５％。表明隨著提取次數的增加，苧麻葉中總酚酸已基本溶出，再提取總酚酸提取率基本不增加，考慮到成本，以提取２次為最佳次數。

２．１．５溶劑體積分數對總酚酸提取率的影響按１．２．３項方法，選取乙醇體積分數分別為５０％、６０％、７０％、８０％作為總酚酸的提取溶劑，結果見圖５。由圖５可以看出，隨著乙醇體積分數的升高，苧麻葉總酚酸的提取率也相應升高，當乙醇體積分數為７０％時提取率達最高（０．０３５％）。但是７０％以后，提取率不再增加。因此乙醇體積分數為７０％時最佳。

２．１．６料液比對總酚酸提取率的影響按１．２．３項方法，選取料液比分別為１∶１５、１∶２０、１∶２５、１∶３０（Ｗ／Ｖ，ｇ：ｍＬ，下同），料液比對總酚酸提取率的影響結果見圖６。圖６表明，隨著料液比的改變，苧麻葉總酚酸提取率隨之改變。當料液比為１∶２０和１∶２５時總酚酸提取率較高，再改變料液比提取率不再增加，故選取１∶２０作為提取料液比。

２．２正交試驗結果分析

由單因素試驗可知，初步確定苧麻葉經纖維酶酶解后，總酚酸提取較佳條件為溫度６０℃、時間

１．０ ｈ、料液比１∶２０、乙醇體積分數７０％、提取２次，ｐＨ值５．０，其中ｐＨ值、提取溫度、提取時間、料液比對總酚酸提取率影響較大，故選取ｐＨ值、溫度、提取時間、料液比按４因素３水平作Ｌ９（３４）正交試驗，其他提取條件為７０％乙醇，加酶量為１％，提取次數為２次。因素與水平設計見表１，結果見表２。

根據表２可知，ｐＨ值、溫度、提取時間、料液比４因素中，對總酚酸提取率影響大小順序為提取時間＞料液比＞ｐＨ值＞溫度，根據各水平結果可知最佳組合為Ａ２Ｂ3Ｃ3Ｄ1，即最佳提取工藝條件為ｐＨ值５．０，料液比１∶２０、溫度7０℃、提取時間2.0 ｈ、提取２次、乙醇體積分數７０％。對上述最佳條件進行驗證試驗，總酚酸提取率為０．０５０％，均高于其他條件組合，證明了其為最優條件。

２．３酶處理對提取苧麻葉總酚酸的影響

按１．２．５項的操作方法，計算加纖維素酶前后總酚酸的提取率，未經酶處理時總酚酸提取率為０．０３７％，而經酶處理后總酚酸提取率為０．０５０％，結果表明，纖維素酶能有效提高苧麻葉中總酚酸提取率。

３結論

在單因素試驗中，提取２次（０．０３５％）與提取３次（０．０３５％）達到相同的總酚酸提取率，故提取次數選取２次，既可縮短提取周期，又可節省溶劑。同時，提取１．０ ｈ和提取２．０ ｈ兩者總酚酸提取率差異不大，所以選取１．０ ｈ作提取時間，而乙醇體積分數為７０％時即具有較佳總酚酸提取率（０．０３５％）；料液比為１∶２０時達最高提取率０．０３５％；提取溫度為６０℃，溫度再升高提取率下降；ｐＨ值在５．０處有最高提取率０．０３６％。其中影響較大的因素為ｐＨ值、提取時間、料液比、提取溫度。

在正交試驗中，根據對各個因素和水平的極差計算，綜合考慮，最佳條件為７０％乙醇、溫度7０℃、料液比１∶２０、提取時間2.0 ｈ、提取次數２次、ｐＨ值為５．０。其極差結果表明，影響苧麻葉中總酚酸提取率的４個因素主次順序為提取時間＞料液比＞ｐＨ值＞溫度。在最佳條件下進行驗證試驗，其提取率為０．０５０％；纖維素酶預處理較未處理時總酚酸提取率有所增加。由此可見試驗采用酶解后提取苧麻葉總酚酸的方法是可行而有效的。

參考文獻：

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［４］ 周媛，鄒坤，汪鋆植，等．苧麻葉中總酚酸提取工藝的正交設計優化［Ｊ］．時珍國醫國藥，２００９，２０（８）：１８６７－１８６９．

［５］ 魏金瑩．纖維素酶在中藥材提取中的應用研究［Ｄ］．天津：天津大學，２００５．

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文