降解大豆抗原蛋白枯草芽孢桿菌的篩選及發酵條件

摘要：用不同來源的１０株枯草芽孢桿菌菌株Ｐ１～Ｐ１０發酵生豆粕，篩選到1株對大豆抗原蛋白７Ｓ伴球蛋白和１１Ｓ球蛋白的降解能力均較強的Ｐ３菌株。采用Ｐ３菌株發酵生豆粕，對發酵條件進行ｐＨ值、接種量、料水比三因素三水平研究，發現在ｐＨ值為６．５，接種量為４％，料水比為１．０∶０．６，Ｐ３菌株可降解９０％以上的抗原蛋白。

關鍵詞：枯草芽孢桿菌；發酵；大豆；抗原蛋白；降解

中圖分類號：S816.34文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）10－1969-03

Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｏｎ Ｄｅｇｒａｄing Ｓｏｙｂｅａｎ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ

ＳＨＩ Ｈｕｉａ，ＺＨＡＯ Ｓｈｕ－ｍｉａｏｂ，ＬＩＡＮＧ Ｙｕｎ－ｘｉａｎｇｂ

（ａ． Ｃｈｕｔｉａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ； ｂ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００７０， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｅｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｔｒａｉｎｓ Ｐ１～Ｐ１０ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ fermentate ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ， ａｎｄ ｏｎｅ ｓｔｒａｉｎ Ｐ３ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ７Ｓ ｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ １１Ｓ ｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｓｅｌｅｃｔｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｐＨ ｗａｓ ６．５， ｔｈｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｗａｓ ４％， ａｎｄ ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｏ ｗａｔｅｒ ｗａｓ １.0∶０．６， ｔｈｅ Ｐ３ ｓｔｒａｉｎｓ ｃｏｕｌｄ ｄｅｇｒａｄｅ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ９０％ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ； ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ； ｓｏｙｂｅａｎ； ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎ； ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ

大豆粕蛋白質含量高達４０％～５５％，含有人體所必需的８種氨基酸，為全價蛋白源，在動物飼料及人的高蛋白營養保健品中常作為優質原材料［１］。但生大豆中含有多種抗營養因子，且所含的主要蛋白質７Ｓ伴球蛋白及１１Ｓ球蛋白均為大分子蛋白質，有很強的抗原性，能激起特異的免疫應答，食用后不僅會導致血清中抗大豆免疫球蛋白ＩｇＧ滴度的升高，而且會造成小腸局部發生器質性的損傷［２］。試驗通過豆粕發酵試驗，篩選出1株對抗原蛋白降解能力較高的枯草芽孢桿菌，最大程度地將大分子的抗原蛋白降解為小分子蛋白，從而提高豆粕的食用安全性和蛋白質的利用消化力。

１材料與方法

１．１試驗材料

１．１．１試劑Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ抽提緩沖液（０．０３ ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ值８．０）。

１．１．２原料新鮮生豆粕（購自東海糧油）。

１．１．３菌株及培養基枯草芽孢桿菌Ｐ１～Ｐ１０，ＰＤＡ培養基（含蔗糖）。

１．２試驗方法

１．２．１降解大豆抗原枯草芽孢桿菌的篩選

１）試驗菌種的準備。將枯草芽孢桿菌Ｐ１～Ｐ１０菌株分別接入ＰＤＡ斜面活化，再分別轉接入ＰＤＡ液體培養基中，在３７℃搖床中培養１８ ｈ作為液體菌種備用。

２）豆粕發酵試驗。稱量豆粕３０ ｇ，將Ｐ１～Ｐ１０菌株以５％和２％的接種量分別接入生豆粕中，加３０ ｍL水混合均勻。將以上混合物裝入５００ ｍL闊口罐頭瓶，并用塑料薄膜封好，３７℃恒溫箱中靜置發酵。

３）發酵樣品抗原蛋白殘留率測定。將未發酵豆粕及Ｐ１～Ｐ１０菌株發酵的豆粕樣品在５０℃烘箱中烘干。每種樣品各稱取１．００ ｇ，加入２０ ｍL ０．０３ ｍｏｌ／Ｌ的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ抽提緩沖液研磨勻漿［３］，修正各樣品ｐＨ值為８．０，浸泡１ ｈ后離心（轉速８ ０００ ｒ／ｍｉｎ，時間１０ ｍｉｎ）去渣，調節上清液ｐＨ值為４．５，離心（轉速

１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ，時間１５ ｍｉｎ），干燥稱重即為各樣品中抗原蛋白的質量，抗原蛋白的殘留率按下式計算：

１．２．２Ｐ３菌株的豆粕發酵條件的初步研究

１）單因子試驗。在溫度為３７℃，以接種量、料水比及ｐＨ值３個因素的不同水平發酵大豆粕，測定各發酵樣品的抗原蛋白殘留率。

２）正交試驗。在單因子試驗的基礎上，選取接種量、料水比及ｐＨ值各３個水平，再設計正交試驗，優化發酵條件，測定各發酵樣品的抗原蛋白殘留率。

２結果與分析

２．１降解大豆抗原蛋白枯草芽孢桿菌的篩選結果

表１結果顯示，Ｐ１，Ｐ５，Ｐ６，Ｐ８，Ｐ９菌株發酵的樣品中抗原蛋白的殘留率高，這些菌株降解抗原蛋白的能力較差。Ｐ２，Ｐ３，Ｐ４，Ｐ７，Ｐ１０菌株發酵的樣品中在５％的接種量下，抗原蛋白的殘留率很低，這些菌株降解抗原蛋白的能力較強。其中Ｐ３菌株在２％及５％的接種量下，抗原蛋白的殘留率均達到最低，故Ｐ３菌株為降解大豆抗原蛋白效果最好的菌株。

２．２Ｐ３菌株發酵條件初步研究結果

２．２．１接種量試驗結果溫度為３７℃，料水比為１．０∶１．０，ｐＨ值為７．０條件下，不同的接種量發酵生豆粕，測得不同發酵樣品中抗原蛋白的殘留率見表２。根據表２，２％的接種量下，發酵樣品的抗原蛋白的殘留率較大，而４％～１０％的接種量下發酵樣品中抗原蛋白的殘留率均大大降低，且差異不明顯。

２．２．２料水比試驗結果溫度為３７℃，接種量為４％，ｐＨ值為７．０條件下，不同的料水比發酵生豆粕，測得不同發酵樣品中抗原蛋白的殘留率見表３。根據表３，料水比為１．０∶０．2、１．０∶０．４時，發酵樣品中的抗原蛋白的殘留率均較高；料水比為１．０∶０．６、１．０∶０．8、１．０∶1．0時，發酵樣品中抗原蛋白的殘留率大為降低，且差異不明顯。

２．２．３ｐＨ值試驗結果溫度為３７℃，接種量為４％，料水比為１．０∶０．６時，在不同ｐＨ值下發酵生豆粕，測得不同發酵樣品中抗原蛋白的殘留率見表４。根據表４，ｐＨ值為６．５時發酵樣品抗原蛋白的殘留率最低。

２．２．4正交試驗結果接種量、料水比及ｐＨ值三因子三水平正交試驗結果見表５。根據表５中極差Ｒ值大小，可以看出料水比對抗原蛋白的殘留率影響最大；在４％～８％的接種量范圍內，接種量對發酵樣品中抗原蛋白的殘留率影響較小；ｐＨ值在６．０～７．０范圍內，對發酵樣品中抗原蛋白的殘留率影響也較小。且通過表５可直接得出，在ｐＨ值為６．５，接種量為４％，料水比為１.0∶０．６時，發酵樣品的抗原蛋白的殘留率最小。

２．３抗原蛋白殘留率測定結果的驗證

試驗中抗原蛋白的殘留率均為多個重復的平均值，且抗原蛋白的殘留率測定結果可以用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳結果來驗證（圖１）。

３小結與討論

大豆抗原蛋白嚴重影響飼喂動物的生長發育，消除大豆抗原蛋白，并增加飼料中小肽的含量，在減少對動物生長發育影響的同時，可提高飼料的價值，國內外在此方面已經有較多的研究。張智等［６］、管風波等［７］、吳暉等［８］通過大豆粕發酵產蛋白酶研究了枯草芽孢桿菌不同菌株的發酵能力；程天德等［９］的研究結果表明，利用枯草芽孢桿菌發酵大豆粕，可以降解８５．３９％的大豆蛋白質。試驗篩選到1株對大豆抗原蛋白降解能力較強的菌株，通過對發酵條件的初步優化，大豆抗原蛋白的降解率可高達到９０．０％以上，優于目前文獻上報道最好的抗原蛋白降解率８５．３９％的結果，具有較好的應用前景。

接種量、料水比和ｐＨ值是影響枯草芽孢桿菌降解大豆抗原蛋白的主要因素，也影響到發酵飼料產品后期干燥的工藝成本。試驗對發酵條件的初步優化，發現在４％的接種量、１．０∶０．６的料水比、ｐＨ值６．５的條件下，所篩選到的Ｐ３菌株對抗原蛋白的降解能力最強，接種量及ｐＨ值與文獻［１０］研究的結果類似，但料水比只需達到１．０∶０．６，優于他們料水比１．０∶１．０的研究結果，可以減少發酵產品干燥過程中的能量損耗。

抗原蛋白的殘留率是評價發酵工藝是否優異，發酵飼料是否達到標準要求的一個重要指標，目前為止，還沒有嚴格的標準來測定發酵豆粕飼料中抗原蛋白的含量。為了快速、準確、高通量地測定發酵飼料產品中抗原蛋白的含量，試驗第一次采用抗原蛋白殘留率來判斷發酵結果。抗原蛋白的殘留率是否有意義與抗原蛋白的提取率密切相關，因此需要找到一種大豆抗原蛋白提取率比較高的提取方法，試驗采用的是文獻［３］的提取方法，抗原蛋白的提取率可達９３．７％。

參考文獻：

［１］ 張乃鋒，王中華．反芻動物小肽的營養研究進展［Ｊ］．草食家禽，２００２（１）：６－９．

［２］ 馮立志．大豆中的抗營養因子［Ｊ］．飼料工業，１９９３（４）：２１－２２．

［３］ ＴＨＡＮＨ Ｖ Ｈ， ＳＨＩＢＡＳＡＫＩ Ｋ． Ｍａｊｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｓｅｅｄｓ： Ａ ｓｔｒａｉｇｈｔｆｏｒｗａｒｄ ｓｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ［Ｊ］．Ｊ ＡｇｒｉｃＦｏｏｄ Ｃｈｅｍ，１９７６，２４：１１１７－１１２１．

［４］ ＦＵＫＵＳＨＩＭＡ Ｄ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， １９９１，７：３５３－３７９．

［５］ ＷＯＬＦ Ｗ Ｊ． Ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ［Ｊ］． Ｊ Ａｍ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ′ Ｓｏｃ，１９７７，５４：１１２Ａ－１１７Ａ．

［６］ 張智，朱宏亮，鈕宏禹，等．響應面法優化枯草芽孢桿菌產蛋白酶的發酵條件［Ｊ］．食品科學，２００８，２９（１２）：４００－４０４．

［７］ 管風波，宋俊梅．枯草芽孢桿菌發酵豆粕產蛋白酶活性的研究［Ｊ］．飼料工業，２００８，２９（１４）：２８－３１．

［８］ 吳暉，卓林霞，解檢清，等．發酵條件對枯草芽孢桿菌發酵豆粕中的蛋白酶活力的影響［Ｊ］．現代食品科技，２００８，２４（１０）：９７３－９７６．

［９］ 程天德，戴必勝，馮小軍．枯草芽孢桿菌蛋白酶水解大豆蛋白的研究［Ｊ］．中國食品工業，２０１０（１）：６０－６１．

［１０］ 卓林霞，吳暉，劉冬梅．枯草芽孢桿菌發酵豆粕產蛋白酶優化試驗研究［Ｊ］．糧食與飼料工業，２００９（２）：３２－３５．

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