家蠶幼蟲黃白血液蛋白差異的雙向電泳分析

摘要：試驗利用黃白繭色限性品種Ｙ９２為材料，在4、5齡幼蟲期，測定了黃血蠶（雌）、白血蠶（雄）的血液蛋白質含量的消長變化，幼蟲血液蛋白質含量隨生長發育逐漸增多，至5齡期第八天到達最高值，黃血蠶９４．３６ μｇ／μＬ，白血蠶５４．８２ μｇ／μＬ。利用雙向電泳技術，比較5齡期第六天幼蟲黃、白血液的蛋白質差異，在蛋白質電泳圖譜中，黃、白血蠶總共檢測到５０７個蛋白點，其中黃血蠶有２８７個蛋白點，白血蠶有２２０個蛋白點，兩者能匹配的蛋白點有２０５對，匹配率達到８０．９％；特異性蛋白點，黃血蠶有８２個，白血蠶有１５個。

關鍵詞：家蠶幼蟲；黃白血液；蛋白質；電泳分析

中圖分類號：Ｓ８８１．２＋４文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）10－2128-03

Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｙｅｌｌｏｗ Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｂｏｍｂｙｘ mｏｒｉ Ｌａｒｖａｅ ｂｙ Ｔｗｏ Ｄｉｍｅｎｔｉｏｎａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ

ＫＯＮＧ Ｑｉｎｇ－mｉｎｇ１，ＺＨＯＮＧ Ｙａｎｇ－sｈｅｎｇ１，ＬＩＮ Ｊｉａｎ－rｏｎｇ１，ＷＡＮＧ Ｙｅ－yｕａｎ１，ＬＩＮ Ｂｉ－mｉｎ１，

ＧＵＯ Ｄｉｎｇ－gｕｏ２，ＬＩＮ Ｚｈｏｎｇ－fｅｎ２

（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６４２， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｓｅｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６４０，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ， ｔｈｅ ｓｅｘ－ｌｉｍｉｔｅｄ ｂｒｅｅｄ ｙｅｌｌｏｗ ａｎｄ ｗｈｉｔｅ ｃｏｃｏｏｎ ｓｉｌｋｗｏｒｍ ｉｎ ｔｈｅ ４ｔｈ ａｎｄ ５ｔｈ ｉｎｓｔａｒ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｒｕｌｅ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｏｆ Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ｌａｒｖａｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｗｉｔｈ ｇｒｏｗｉｎｇ ａｎｄ ｒｅａｃｈｅｄ peak ｉｎ ｔｈｅ ８ｔｈ ｄａｙ ｏｆ ｔｈｅ ５ｔｈ ｉｎｓｔａｒ． Ｆｏｒ ｙｅｌｌｏｗ－ｂｌｏｏｄ ｓｉｌｋｗｏｒｍ （ｆｅｍａｌｅ） ｉｔ ｗａｓ ９４．３６ μｇ／μＬ； ａｎｄ ｆｏｒ ｗｈｉｔｅ－ｂｌｏｏｄ ｓｉｌｋｗｏｒｍ（ｍａｌｅ） ｉｔ ｗａｓ ５４．８２ μｇ／μＬ． Ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ （２－ＤＥ） ａｎｄ ｇｅｌ ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ， ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍａｌｅ ａｎｄ ｆｅｍａｌｅ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｓｉｌｋｗｏｒｍ ａｔ ｔｈｅ ６ｔｈ ｄａｙ ｉｎ ｔｈｅ ５ｔｈ ｉｎｓｔａｒ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ． Ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ ５０７ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｏｔｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ２－ＤＥ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ｍａｌｅ ａｎｄ ｆｅｍａｌｅ ｂｌｏｏｄ， ｏｆ ｗｈｉｃｈ ２８７ ｂｅｌｏｎｇed ｔｏ ｆｅｍａｌｅ ａｎｄ ２２０ ｂｅｌｏｎｇed ｔｏ ｍａｌｅ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ 205 ｐａｉｒｓ ｗｅｒｅ ｍａｔｃｈｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ２－ＤＥ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｂｏｔｈ ｍａｌｅ ａｎｄ ｆｅｍａｌｅ， ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍａｔｃｈ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ａｓ ｈｉｇｈ ａｓ ８０．９％． Ｔｈｅｒｅ ａｒｅ ８５ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｏｔｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ ｆｅｍａｌｅ ａｎｄ １５ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ ｍａｌｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ｌａｒｖａｅ； ｙｅｌｌｏｗ ａｎｄ ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ； ｐｒｏｔｅｉｎ； ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎａｌｙｓｉｓ

家蠶是一種絹絲昆蟲，一直是生物學研究的模式昆蟲，由于蠶能夠泌絲結繭，因而具有很高的經濟利用價值。近年，蠶業科技工作者進一步對天然彩色繭絲資源進行了拓展利用，并就彩色繭形成的機理作深入地研究。Ｊｏｕｎｉ等［１］通過硫酸銨沉淀、濃縮和陰離子交換層析等技術，在結黃繭的５齡幼蟲中腸中發現了一種葉黃素結合蛋白（ｌｕｔｅｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＬＢＰ），該蛋白的等電點為５．４，相對分子量３５ ｋＤ。Ｔａｂｕｎｏｋｉ等［２］在家蠶黃繭品種的絲腺組織中分離純化出一種類胡蘿卜素結合蛋白（ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＢＰ），并對其進行了ｃＤＮＡ的序列分析，ＣＢＰ的表達由顯性的黃血Ｙ基因調控，含２９７個氨基酸殘基，大小為３３ ｋＤ，以１∶１的摩爾比結合葉黃素，該蛋白在中腸上皮細胞和中部絲腺內膜中發揮著輔助吸收和再分配類胡蘿卜素的功能。Ｔｓｕｃｈｉｄａ等［３］以４種家蠶突變體為材料，通過對脂肪酸轉運與代謝的研究，認為家蠶Ｙ基因隱性突變體的血液和蠶繭無色的原因可能是類胡蘿卜素的轉運與細胞吸收缺陷而引起的。Ｓａｋｕｄｏｈ等［４］對ＣＢＰ在前胸腺的表達分析研究中，分離鑒定了一種新的類胡蘿卜素結合蛋白ＢｍＳｔａｒｔ１，ＢｍＳｔａｒｔ１基因與ＣＢＰ正向同源，在家蠶黃、白繭品種中均有表達。隨著后基因組時代即功能基因組時期的來臨，蛋白質組學（Ｐｒｏｔｏｅｍｉｃｓ）的應用越來越受到重視［５，６］。自從１９９４年Ｗｉｌｋｉｎｓ和Ｗｉｌｌｉａｍｓ第一次提出蛋白質組（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ）的概念以來，蛋白質組學的研究得到了空前的發展，相關技術的研究也取得了重大突破［７，８］。家蠶蛋白質組的研究，科學工作者正以家蠶胚胎、絲腺、血液等組織器官為材料，采用雙向電泳分離技術、質譜分析等鑒定技術，開展功能蛋白的探索研究，構筑參考圖譜和家蠶蛋白質數據庫，查找與生長發育有關的功能蛋白，從而在蛋白質水平上闡明家蠶生長發育、代謝調控等生命活動的規律。與原核生物、酵母、人類的蛋白質組學研究相比，家蠶蛋白質組學還處在發展的初期階段。為進一步探索家蠶有色繭的形成機制，我們利用雙向電泳技術對結黃白繭的家蠶幼蟲的黃、白血液蛋白進行電泳圖譜的差異分析，查找與繭色素相關聯的蛋白。

１材料與方法

１．１材料

供試家蠶品種：Ｙ９２（黃白繭色限性品種），雌蠶黃血結黃繭，雄蠶白血結白繭，由華南農業大學蠶絲科學系提供。

１．２材料處理

常規飼養Ｙ９２品種至4齡期，從４期開始，每天腹足取血，在血樣本中加入微量苯基硫脲防氧化，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ，４°Ｃ離心２０ ｍｉｎ，取上清，按Ｂｒａｄｆｏｒｄ法測定蛋白質含量，分裝后置于－８０℃保存。等電聚焦電泳前，根據所測蛋白質含量，將血液與裂解液適當比例混合，冰上裂解１ ｈ，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ，離心３０ ｍｉｎ，取上清備用。

１．３雙向電泳分析

第一向等電聚焦電泳（ＩＥＦ）使用ＩＰＧｐｈｏｒⅡ等電聚焦儀，參照儀器使用說明書進行操作，使用１８ ｃｍ，ｐＨ值３～１０的ＩＰＧ干膠條，３００ μｇ上樣量；第二向ＳＤＳ－ＰＡＧＥ使用１２％的分離膠，電泳后的凝膠，參考Ｙａｎ等［９］的方法進行銀染。雙向電泳圖譜利用Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司的Ｉｍａｇｅ ＭａｓｔｅｒＴＭ２Ｄ Ｐｌａｔｉｎｕｍ ５．０軟件進行分析，按照說明書操作。

１．４質譜鑒定

委托上海中科新生命生物技術有限公司采用電噴霧串聯質譜（ＥＳＩ－ＭＳ－ＭＳ）進行蛋白質檢測分析。

２結果與分析

２．１幼蟲4、5齡期黃血、白血蠶的血液蛋白含量變化

為了解Ｙ９２品種4、5齡期黃血、白血幼蟲體血液蛋白含量的變化情況，從４齡第一天開始，測定各天血液蛋白質含量，結果見圖１。

從圖１可知，Ｙ９２幼蟲4、5齡期血液蛋白質含量隨生長發育逐漸增多，５齡第八天到達最高值，黃血蠶９４．３６ μｇ／μＬ，白血蠶５４．８２ μｇ／μＬ。黃、白血幼蟲體中的血液蛋白質含量在５齡第五天后逐漸變大，第八天達到最大，黃血蠶血液蛋白質含量高出白血蠶３９．５４ μｇ／μＬ。

２．２雙向電泳分析

家蠶Ｙ９２幼蟲５齡第六天黃血蠶（雌）、白血蠶（雄）的血液蛋白樣品經雙向電泳分析和銀染法染色，其圖譜如圖２所示。

經ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒＴＭ２Ｄ Ｐｌａｔｉｎｕｍ ５．０軟件分析，在圖２的黃血蠶、白血蠶５齡幼蟲的血液蛋白中共檢測到５０７個蛋白點，其中黃血蠶蛋白點２８７個，白血蠶蛋白點２２０個，相互能匹配的蛋白點有２０５對，匹配率為８０．９％；特異性蛋白點黃血蠶有８２個，白血蠶有１５個，其等電點和分子量列于表１、表２。

從表１和表２的結果看，黃血蠶特異性蛋白，分子量在１０～２９．９ｋＤ的占了總數的１３．４１％；３０～４９．９ｋＤ的占了總數的２３．１７％；７０～８９．９ｋＤ的占了總數的３９．０２％；９０ｋＤ以上的占了總數的１９．５１％。白血蠶的１５個特異性蛋白點，分子量的大小在１０～９９ｋＤ。在特異蛋白中，黃血蠶和白血蠶蛋白的等電點絕大多數分布在４.0～９．５。

對黃血、白血相配匹配的２０５對蛋白，經比對分析，黃血蠶血液蛋白含量為白血蠶３倍及以上的匹配蛋白點有４８對（表３），差異３.0～４．９倍的有２６個；５.0～６．９倍的有９個；７.0～８．９倍的有３個；９.0倍以上的有１１個。而白血蠶血液蛋白含量大于黃血蠶３倍以上的匹配蛋白點卻只有１８對（表４），差異３.0～４．９倍的有１１個；５.0～６．９倍的有２個；７.0～８．９倍的有２個；９倍以上的有２個。

２．３黃血特異蛋白點的ＥＳＩ～ＭＳ～ＭＳ鑒定分析

通過從分析黃血蠶與白血蠶的雙向電泳圖譜（圖２），我們發現黃血特異蛋白點中的２５４０號是一個白血蠶沒有的、且容易提取的特異蛋白，于是將該蛋白提取送上海中科新生命生物技術有限公司用電噴霧串聯質譜（ＥＳＩ－ＭＳ－ＭＳ）進行質譜分析，圖譜如圖３所示。

質譜分析得到５段肽段序列，分別為：

ＶＦＧＴＬＧＱＮＤＤＧＬＦＧＫ

ＥＩＦＮＤＤＲＧＫＬＴＧＱＡＹＧＴＲＶＬＧＰＡＧＤＳＴＮＹＧＧＲ

ＮＡＥＡＡＩＤＩＮＲ

ＳＧＭＴＡＴＧＳＧＶＷＤＬＤＫＮＴＲＬＳＡＧＧＭＶＳＫ

ＲＰＤＶＧＶＱＡＥＦＲ

對以上序列，經與Ｉｎｓｅｃｔａ和Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ蛋白數據庫的相關蛋白進行比對，與ｇｌｏｖｅｒｉｎ～ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４［Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ，在ＮＣＢＩ數據庫中的登錄號為５２４２１２１］有９５個氨基酸相匹配，匹配率為５５．５６％。

３討論

家蠶繭色素物質的形成，是幼蟲期蠶體從攝取的桑葉物質中轉化而成，因而，蠶結黃繭還是白繭，繭色的表現如何，除了遺傳基因起決定作用外，桑葉中的葉黃素、黃酮類化合物等色素物質能否被消化吸收，透過腸膜進入血腔再進入絹絲腺中，透過性便是一道屏障［１０］。根據我們對Ｙ９２血液的顏色觀察，從３齡幼蟲期的腳色便可觀察出雌雄血液的顏色差異（雌黃血、雄白血），表明葉黃素、黃酮類化合物等色素物質已經在蠶體的血腔中形成，由此推測，色素物質在３齡前已經合成或桑葉中的色素物質經蠶體消化吸收進入到了血腔中。

從血液總蛋白含量的測定結果看，大蠶期的幼蟲由于食桑量多，代謝旺盛，能大量將桑葉中的營養物質通過消化吸收，透過中腸腸壁進入血腔后合成蛋白質，使體內血淋巴的蛋白質含量逐漸積累性增多，到成熟前的第二天（５齡經過第八天），血液中的蛋白質含量最高，黃血蠶９４．３６ μｇ／μＬ，白血蠶５４．８２ μｇ／μＬ。黃血蠶與白血蠶的血液蛋白含量出現了較大的差別，此原因可能是黃血蠶（雌）的性腺旺盛發育，代謝比白血蠶（雄）大而產生的。家蠶在眠期，由于不食桑葉，而體內卻進行著蛻皮的生理代謝，仍需大量消耗能量，此時血淋巴中的一部分蛋白質就會被轉化為能量物質而消耗掉，故４齡期蠶和５齡期蠶時的血液蛋白含量均相對較低。

蠶體吐彩色繭絲的生理生化機制，目前國內外的研究報道不多，主要的報道有胡蘿卜素、葉黃素從血淋巴到中部絲腺的的轉運過程中，可能通過色素結合蛋白而實現在蠶體內的轉運代謝的［１－３］。Ｊｉｎ等［１１］用雙向電泳和計算機輔助分析方法發現一些蛋白高豐度地表達在家蠶黃繭限性品種的中部絲腺中，推測這些蛋白可能與家蠶繭色形成相關，本文利用雙向電泳的圖譜，比較分析了Ｙ９２黃血蠶與白血蠶蛋白的差異，特異蛋白方面，雌（黃血蠶）比雄（白血蠶）多，黃血蠶有８２個，白血蠶有１５個。相互匹配的蛋白點有２０５對，占能檢測到的８０．９％；但其量值仍有較大的差別，黃血蠶有較多高豐度蛋白的表達，黃血蠶大于白血蠶３～４倍的蛋白點有２６個，９倍以上的有１１個。白血蠶大于黃血蠶３～４倍的蛋白斑點只有１１個，９倍以上的有２個。這一現象是否暗示了同一類別的蛋白，在不同血色或雌雄間可能表達著不同的活性與功能。至于兩者之間存在著怎樣的相互作用機制，以及這些蛋白在繭色素物質的代謝中起著怎樣的作用，今后還需要更多的研究來揭示。

本試驗雖然研究了家蠶繭色限性品種Ｙ９２幼蟲4、5齡期血液蛋白的代謝變化規律，運用蛋白質組學的技術探討了血液蛋白組分的差異表達，然而家蠶的繭色調控機制卻非常復雜，有關色素在蠶體內的合成與轉運機制仍有待我們今后繼續研究。

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注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文