稻瘟病新抗性基因Pita2候選基因的表達載體構(gòu)建

摘要：為了驗證稻瘟病新抗性基因Ｐｉｔａ２的功能，利用長片段ＰＣＲ技術(shù)從基因的供體品種ＰｉＮｏ．４中擴增了２個候選基因Ｐｉｔａ２－１，Ｐｉｔａ２－２，長度分別為６．１ ｋｂ和１６．５ ｋｂ，電泳回收目的片段，然后利用雙酶切分別克隆到植物表達載體ｐＣＡＭＢＩＡ１３００。對陽性克隆通過菌落ＰＣＲ、酶切鑒定和測序分析，已成功地獲得了２個候選基因的重組陽性克隆，為進一步研究Ｐｉｔａ２基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：稻瘟病；候選抗性基因；長片段ＰＣＲ技術(shù)；表達載體

中圖分類號：Ｑ７８６文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）10－2133-03

Construction of Expression Vector for Candidate Genes of New Rice Blast

Resistance Gene Pita2

ＺＨＡＮＧ Ｊｉ－ｃｈｅｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｘｉａｎｇ－ｍｉｎｇ，ＷＡＮＧ Ｃｈｕｎ－ｔａｉ，ＬＩＵ Ｘｕｅ－ｑｕｎ，ＸＵ Ｘｉｎ，ＬＩＵ Ｘｉｎ－ｑｉｏｎｇ

（Ｋｅｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔａｔｅ Ｅｔｈｎｉｃ Ａｆｆａｉｒｓ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ， Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓｏｕｔｈ－Ｃｅｎｔｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ， Ｗｕｈａｎ ４３００７４）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ ｉｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｄｅｖａｓｔａｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｒｉｃｅ， ａｎｄ ａ ｓｅｒｉｏｕｓ ｔｈｒｅａｔ ｔｏ ｒｉｃｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｎｅｗ ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｓｔｒａｔｅｇｙ． Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｇｅｎｅｓ Ｐｉｔａ２－１ ａｎｄ Ｐｉｔａ２－２， ｌｏｎｇ－ｒａｎｇｅ ＰＣＲ（ＬＲ－ＰＣＲ） ｗａｓ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ｔｈｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｕｌｔｉｖａｒ ＰｉＮｏ．４． Ｔｈｅ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ Ｐｉｔａ２－１（６．１ ｋｂ）ａｎｄ Ｐｉｔａ２－２（１６．５ ｋｂ） ｗｅｒｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｌｉｇａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｂｉｎａｒｙ ｖｅｃｔｏｒ ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｌｏｎｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｂｙ ｃｏｌｏｎｙ ＰＣＲ， ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ， ｔｈｕｓ ｌａｉｄ ａ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ Ｐｉｔａ２．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ； ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ； ｌｏｎｇ－ｒａｎｇｅ ＰＣＲ； ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ

稻瘟病是最具毀滅性的水稻病害之一，嚴重威脅著水稻的生產(chǎn)。相對于化學防治法的高成本和高污染，培育和合理利用抗病品種，是控制這一病害最經(jīng)濟和環(huán)保的方式手段［１，２］。由于稻瘟病菌生理小種的遺傳復雜性及易變性，抗病品種常常推廣種植幾年后就喪失抗性［３，４］。發(fā)掘和創(chuàng)造具有廣譜抗性的新抗源和抗性基因，是抗稻瘟病育種的主要研究方向。稻瘟病廣譜新抗性基因Ｐｉｔａ２被定位于水稻第１２條染色體著絲粒區(qū)域一個大的基因簇內(nèi)［５］。而這一基因簇包含了１４個已知的稻瘟病抗性基因，包括Ｐｉ２０、Ｐｉｔａ、Ｐｉｔａ２、Ｐｉ４、Ｐｉ６、Ｐｉ１２、Ｐｉ１９、Ｐｉ２１、Ｐｉ２４、Ｐｉ３１、

Ｐｉ３２、Ｐｉ１５７、Ｐｉｔｑ－６和Ｐｉ３９［６］。盡管Ｐｉｔａ已被克隆，并與相應的無毒基因間互作已在分子水平上得到了闡述［７］，但由于著絲粒區(qū)域的高度重復序列和抑制重組的特性，導致這一區(qū)域的研究進展緩慢。

開展稻瘟病廣譜抗性基因Ｐｉｔａ２的克隆及功能研究，對加快著絲粒相關(guān)區(qū)段基因資源的開發(fā)和有效利用，以及新的抗性品種育成具有重要的應用價值，同時也對探討抗性基因的起源及其進化的分子機理具有一定的參考價值。

１材料與方法

水稻品種為攜帶Ｐｉｔａ２的抗病品種ＰｉＮｏ．４，大腸桿菌菌株ＤＨ１０Ｂ，雙元載體ｐＣＡＭＢＩＡ１３００，均由中南民族大學生物技術(shù)國家民委重點實驗室提供。ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶長片段ＰＣＲ擴增試劑盒（ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶，２×ＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ，ｄＮＴＰ），Ｔ４ ＤＮＡ連接酶，堿性磷酸酶（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ。ＣＩＡＰ），購自ＴａＫａＲａ公司；ＡｘｙＰｒｅｐ質(zhì)粒提取試劑盒、ＤＮＡ凝膠回收試劑盒，以及ＰＣＲ清潔試劑盒，購自愛思進生物技術(shù)（杭州）有限公司；ＰＣＲ引物由金思瑞科技（南京）有限公司合成。

水稻基因組ＤＮＡ利用ＣＴＡＢ法提取。利用軟件Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０對Ｐｉｔａ２的２個候選基因Ｐｉｔａ２－１和Ｐｉｔａ２－２設(shè)計特異性引物。利用長片段ＰＣＲ技術(shù)擴增目的片段，擴增片段包括基因的５′啟動子和３′終止子區(qū)域，ＰＣＲ程序采用兩步法：９４℃預變性２ ｍｉｎ，然后進行３０個循環(huán)：９４℃，３０ ｓ；６５℃，６．５ ｍｉｎ；７２℃，１０ ｍｉｎ，其中退火溫度和延伸時間根據(jù)候選基因的大小和引物序列作相應的變化。用ＡｘｙＰｒｅｐ膠回收試劑盒分別回收和純化目的片段后，將2個候選基因利用限制性內(nèi)切酶ＫｐｎⅠ和ＨｉｎｄⅢ分別克隆到ｐＣＡＭＢＩＡ１３００載體上。然后對陽性克隆通過菌落ＰＣＲ和酶切鑒定，并且測序驗證。

２結(jié)果與分析

２．１候選基因的擴增

以Ｐｉｔａ２候選基因的特異性引物對水稻品種ＰｉＮｏ．４的基因組ＤＮＡ進行長片段ＰＣＲ梯度擴增。候選基因Ｐｉｔａ２－１在退火溫度為６４．１℃和６３．０℃時，都獲得了１條６．１ ｋｂ的特異性好而強的單帶（圖１）；Ｐｉｔａ２－２在退火溫度為６２．８℃和６２．０℃時，均獲得了１條１６．５ ｋｂ的特異性較好的單帶（圖２）。

２．２候選基因的表達載體構(gòu)建

對擴增的目的片段，分別回收、純化，利用雙酶切分別克隆到ｐＣＡＭＢＩＡ１３００載體，經(jīng)藍白斑篩選，菌落ＰＣＲ和酶切鑒定（圖３，圖４），分別獲得２個候選基因的陽性重組子。對插入片段測序后，在ＧｅｎＢａｎｋ中通過ＢＬＡＳＴＮ進行核酸同源性搜索（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）。結(jié)果表明，插入片段的序列著陸到水稻測序品種日本晴的第１２條染色體上，該區(qū)域與目的基因的物理定位區(qū)域一致。

３討論

在完成圖位克隆中的抗性基因精細定位后獲得圖位克隆是最關(guān)鍵的步驟，最關(guān)鍵步驟是獲得目的基因的候選基因克隆，但在常規(guī)的圖位克隆技術(shù)體系中，通常通過構(gòu)建大片段基因組人工染色體文庫，然后利用與目的基因共分離的分子標記來篩選文庫而獲得其候選基因的克隆，該過程由于必須對該候選基因進行亞克隆，而且亞克隆技術(shù)存在耗時、花費高的缺點［7，8］，而且對篩選到的候選基因克隆必須亞克隆才能進行遺傳轉(zhuǎn)化。而亞克隆技術(shù)存在切斷目的基因甚至遺漏目的基因等缺點［７，８］。通過長片段ＰＣＲ技術(shù)可以快速、高效地直接從基因組ＤＮＡ中擴增得到完整的目的基因［９，１０］，這將極大地縮短圖位克隆的時間。該研究中利用長片段ＰＣＲ技術(shù)成功地獲得了２個候選基因片段，并通過雙酶切將其克隆到植物表達載體ｐＣＡＭＢＩＡ１３００，下一步將通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入感病品種。該研究為稻瘟病新抗性基因Ｐｉｔａ２的功能驗證奠定了一定的基礎(chǔ)。

參考文獻：

［１］ ＺＨＡＮＧ Ｑ Ｆ． Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｇｒｅｅｎ ｓｕｐｅｒ ｒｉｃｅ［Ｊ］． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｉ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００７，１０４：１６４０２－１６４０９．

［２］ ＶＡＬＥＮＴ Ｂ， ＣＨＵＭＬＥＹ Ｆ Ｇ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ ｆｕｎｇｕｓ， Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ［Ｊ］． Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９１，２９：４４３－４６７．

［３］ ＹＯＳＨＩＤＡ Ｋ，ＳＡＩＴＯＨ Ｈ，ＦＵＪＩＳＡＷＡ Ｓ，ｅｔ ａｌ． Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｒｅｅ ｎｏｖｅｌ ａｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ ｆｕｎｇａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ［Ｊ］． Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２００９， ２１：１５７３-１５９１．

［４］ ＨＩＴＴＩＮＧＥＲ Ｃ Ｔ，ＣＡＲＲＯＬＬ Ｓ Ｂ． Ｇｅｎｅ ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ａｄａｐｔｉｖｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｌａｓｓｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｗｉｔｃｈ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ，２００７， ４４９：６７７-６８１．

［５］ ＲＹＢＫＡ Ｋ，ＭＩＹＡＭＯＴＯ Ｍ，ＡＮＤＯ Ｉ，ｅｔ ａｌ． Ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｄｉｃａ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ＩＩ． Ｐｉｔａ２ ａｎｄ Ｐｉｔａ ａｎｄ ａ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｏｒｉｇｉｎ［Ｊ］． Ｍｏｌ． Ｐｌａｎｔ－Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ，１９９７，１０（４）：５１７－５２４．

［６］ ＬＩＵ Ｘ，ＹＡＮＧ Ｑ，ＬＩＮ Ｆ，ｅｔ ａｌ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｉｎｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ Ｐｉ３９（ｔ）， ａ ｍａｊｏｒ ｇｅｎｅ ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ ｔｈｅ ｂｒｏａｄ－ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ［Ｊ］． Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００７， ２７８（４）：４０３－４１０．

［７］ 黃驥，張紅生，曹雅君，等．水稻功能基因的電子克隆策略［Ｊ］． 中國水稻科學，２００３，１６（４）：２９５－２９８．

［８］ 吳乃虎． 基因工程原理［Ｍ］． 北京：科學出版社，２００１．５６－５９．

［９］ ＳＯＮＧ Ｊ Ｑ，ＢＲＡＤＥＥＮ Ｊ Ｍ，ＮＡＥＳＳ Ｓ Ｋ，ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ ＲＢ ｃｌｏｎｅｄ ｆｒｏｍ Ｓｏｌａｎｕｍ ｂｕｌｂｏｃａｓｔａｎｕｍ ｃｏｎｆｅｒｓ ｂｒｏａｄ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｐｏｔａｔｏ ｌａｔｅ ｂｌｉｇｈｔ［Ｊ］． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｉ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００３，１００（１６）：９１２８－９１３３．

［１０］ ＬＩＵ Ｘ Ｑ，ＬＩＮ Ｆ，ＷＡＮＧ Ｌ，ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｍａｐ－ｂａｓｅｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ Ｐｉ３６， ａ ｒｉｃｅ ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ–ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ–ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ ｇｅｎｅ ｔｈａｔ ｃｏｎｆｅｒｓ ｒａｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ ｂｌａｓｔ ｆｕｎｇｕｓ［Ｊ］． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００７，１７６：２５４１-２５４９．

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文