十二份三系雜交稻親本的指紋圖譜構建與應用

摘要：選取分布于水稻１２條染色體上的１１２對ＳＳＲ引物對１２份雜交稻親本進行多態性分析，檢測出３５對多態性引物。選取其中２５對多態性好的引物構建了１２份雜交稻親本的指紋圖譜。利用特異引物分別對萬優２號和Ｋ優８８的雜交種進行純度鑒定，結果表明，分子標記純度鑒定與田間鑒定結果差異不明顯。

關鍵詞：雜交稻；指紋圖譜；純度鑒定

中圖分類號：Ｑ７８９文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）10－2122-03

Construction and Application of Fingerprinting Map of 12 Ternary Hybrid Rice Parents based on SSR Marker

ＨＵ Ｊｉｎｇ－ｔａｏ，ＨＵＡＮＧ Ｗｅｎ－ｚｈａｎｇ，ＹＡＮ Ｍｉｎｇ－ｊｉａｎ，ＨＵＡＮＧ Ｃｈｅｎｇ－ｚｈｉ，ＬＥＩ Ｓｈｕ－ｆａｎ，Ｌ?譈 Ｚｈｉ－ｗｅｎ

（Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｔｈｒｅｅ Ｇｏｒｇｅｓ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｗａｎｚｈｏｕ ４０４１５５， Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ １２ ｔｅｒｎａｒｙ ｈｙｂｒｉｄ ｒｉｃｅ ｐａｒｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｔａｋｅｎ ｂｙ ｃｈｏｏｓｉｎｇ １１２ ｐａｉｒｓ ｏｆ ＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｒｏｍ １２ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｏｆ ｒｉｃｅ； and ３５ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｔ ｌａｓｔ． ２５ ｐａｉｒｓ ｏｆ ＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｈｉｃｈ ｓｈｏｗｅｄ ｈｉｇｈｅｒ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｔｈｅ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ｍａｐｓ ｏｆ ｔｈｅ １２ ｔｅｒｎａｒｙ ｈｙｂｒｉｄ ｒｉｃｅ ｐａｒｅｎｔｓ． Ｔｈｅ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｓｅｅｄ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ Ｗａｎｙｏｕ－２ ａｎｄ Ｋｙｏｕ－８８． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ result of ＳＳＲ ｔｅｓｔ ａｎｄ ｆｉｅｌｄ ｔｅｓｔ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｈｙｂｒｉｄ ｒｉｃｅ； ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ｍａｐ； ｐｕｒｉｔｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ

ＤＮＡ指紋反映同種生物體中的個體差異，由于個體ＤＮＡ序列信息具有相對的穩定性，因此可結合現代分子生物學方法構建指紋圖譜。在水稻研究中，指紋圖譜可用于雜交稻種子的真偽及純度鑒定，避免田間鑒定的繁瑣工作，同時為品種或材料申請專利保護提供分子水平的依據。

ＳＳＲ作為基因組研究中的一種主要分子標記技術，在水稻中，已經廣泛應用于遺傳多樣性分析、品種鑒定及遺傳圖譜構建等研究。李云海等［１］利用ＳＳＲ標記分析了生產上常用的雜交稻親本，結果表明，生產中主要應用的水稻雄性不育系遺傳背景較為單一。郭慧等［２］利用ＳＳＲ標記分析了２４份水稻雄性不育系的遺傳多樣性，結果表明，四川及其他省（區）使用的細胞質雄性不育系之間的遺傳基礎較窄。姜樹坤等［３］利用ＳＳＲ標記對遼寧省大面積種植的１４個主栽品種進行了遺傳多樣性分析，結果表明，多數品種的親緣關系較近，多樣性不夠豐富。李進波等［４］利用ＳＳＲ標記對兩系雜交稻兩優培勝的種子純度進行了鑒定，結果與田間種植鑒定的結果完全吻合。曾大力等［５］對湖北省某公證處封存的２份雜交稻材料進行了真假鑒定，結果顯示２份材料的微衛星指紋差異明顯。肖小余等［６］利用ＳＳＲ標記對四川省主推雜交稻品種進行了指紋圖譜構建及品種鑒定，從指紋數據庫中篩選出了用于Ｄ優５２７純度及真偽鑒定的特異引物。詹天才［７］利用ＳＳＲ標記對雜交稻種子進行了純度鑒定，用兩對多態性引物分別對摻假的威優４６和金優２０７兩個品種分別進行純度鑒定，結果發現兩者都能有效地將摻入組合中的假種子區分開。彭鎖堂等［８］利用ＳＳＲ引物構建了９個雜交稻組合親本的指紋圖譜，組合純度鑒定表明分子標記純度鑒定與田間種植鑒定結果無顯著差異。

研究選取分布于水稻１２條染色體上的ＳＳＲ引物１１２對，對重慶市常用雜交稻親本進行多態性分析，并構建指紋圖譜，以期為雜交稻品種的真偽及純度鑒定等提供分子水平的依據。

１材料與方法

１．１材料

雜交稻親本共１２份，包括６份不育系（中九Ａ、Ｋ１８Ａ、協青早Ａ、金２３Ａ、川香２９Ａ、宜香１Ａ）及６份恢復系（萬恢８８、輻恢８３８、蜀恢５２７、綿恢７２５、萬恢６４６、萬恢３５５）。純度鑒定材料為萬優２號（宜香１Ａ／萬恢３５５）和Ｋ優８８（Ｋ１８Ａ／萬恢８８）。

１．２ＤＮＡ提取

取雜交稻親本種子各２０粒左右，雜交種萬優２號和Ｋ優８８各５００粒，單獨浸種并催發幼苗，待幼苗生長到約５ ｃｍ時取單粒苗分別提取ＤＮＡ，ＤＮＡ提取采用ＣＴＡＢ法［９］。

１．３ＰＣＲ擴增

引物序列來自網站（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｒａｍｅｎｅ．ｏｒｇ／ｍｉｃｒｏｓａｔ），由上海英駿生物技術有限公司合成。ＰＣＲ儀為Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌ。２５ μＬ的反應體系中包括：１０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ值８．３），５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ，１．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２，１ＵＴａｑ酶，４ ｎｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ，１０ ｐｍｏｌ／Ｌ引物，２０ｎｇ模板ＤＮＡ。ＰＣＲ程序為：９４℃預變性５ ｍｉｎ；９４℃變性３０ｓ，５５℃復性３０ ｓ，７２℃延伸４５ ｓ，３５個循環；７２℃再延伸１０ ｍｉｎ。每管反應產物中加入２ μＬ溴酚藍（含０．２５％溴酚藍和４０％蔗糖水溶液），再用３％的瓊脂糖凝膠電泳，ＥＢ染色后于凝膠成像系統上觀察記錄。

１．４數據處理

選取擴增效果好的引物進行數據統計。每對ＳＳＲ引物檢測一個位點，視每對ＳＳＲ引物擴增產物中具有相同電泳遷移率的一條多態性條帶為一個等位基因，并將清晰條帶賦值為“１”，無條帶賦值為“０”，構建親本指紋數據庫。ＳＳＲ標記進行純度鑒定時，真雜交種應同時具有雙親電泳譜帶，只具一個親本電泳譜帶的均視為雜株。

１．５田間純度鑒定

２０１０年于重慶三峽農業科學院高峰試驗基地種植雜交稻萬優２號及Ｋ優８８各１ ０００株，試驗設３次重復。田間管理同大田生產，觀察植株形態并鑒定其純度。

２結果與分析

２．１１２份雜交稻親本的指紋圖譜構建

選取分布于水稻１２條染色體上的１１２對ＳＳＲ引物，對１２份雜交稻親本進行多態性分析，篩選出具有多態性的引物３５對，占所用引物的３１．２５％，每對引物檢測到的等位基因數為２～４個。選取多態性較好的２５對引物構建指紋圖譜，２５對引物的特異條帶組合構成一個親本材料的指紋，該指紋可用于相應雜交稻組合的真偽及純度鑒定。

２．２萬優２號及Ｋ優８８的特異引物篩選

萬優２號的親本宜香１Ａ與萬恢３５５之間有１３對條帶清晰、多態性好的ＳＳＲ引物（圖１）。其中ＲＭ１７可以將宜香１Ａ與其他所有材料區分開，ＲＭ２５２和ＲＭ２３７可以將萬恢３５５與其他恢復系區分開，這3對引物構成萬優２號及其親本的特異引物。

Ｋ優８８的親本Ｋ１８Ａ與萬恢８８之間有９對多態性好的ＳＳＲ引物（圖２）。ＲＭ１、ＲＭ１４４可以將Ｋ１８Ａ與其他不育系區分開，ＲＭ２１３和ＲＭ３４１可以將萬恢８８與其他恢復系區分開，這４對引物構成Ｋ優８８及其親本的特異引物。

２．３萬優２號和Ｋ優８８純度鑒定

利用親本差異引物ＲＭ１７和ＲＭ３４１分別對雜交種萬優２號與Ｋ優８８進行純度鑒定。３００個單株中，萬優２號共檢測出雜株１１株，雜株率為３．６７％；Ｋ優８８共檢測出雜株１３株，雜株率為４．３３％（圖３）。兩者田間鑒定檢出雜株率分別為２．４０％和３．４０％，兩種鑒定方法所得結果比較吻合，說明ＳＳＲ標記純度鑒定與田間鑒定具有較好的一致性。

３討論

利用ＳＳＲ分子標記構建雜交稻親本指紋圖譜后，可從中尋找相關雜交稻組合的特異引物，并用于該組合雜交種子的純度及真偽鑒定。研究利用多態性較好的２５對ＳＳＲ引物構建了１２份雜交稻親本的指紋圖譜，從指紋數據庫中篩選出雜交稻萬優２號和Ｋ優８８親本的特異引物，并對兩組合的雜交一代種進行了純度鑒定。結果表明，田間鑒定與ＳＳＲ標記鑒定結果無明顯差異，說明利用ＳＳＲ分子標記進行雜交稻種子純度鑒定結果準確可靠。比較而言，田間純度鑒定容易受到氣候等外界條件的影響，且費時費力；利用ＳＳＲ標記進行純度鑒定則可以完全在實驗室內完成，受外界條件影響較小，并且其重復性好、操作簡單、用時短，研究從催發幼苗到完成ＰＣＲ共耗時１０ ｄ。

利用引物ＲＭ３４１對Ｋ優８８進行純度鑒定時，雜交種除出現雙親的互補帶型外，還有一條較弱的第三條電泳帶。辛業蕓等［１０］認為，此種電泳帶的產生是由于雜交種的雜合鏈所致。如果這種電泳帶的確由雜交種的雜交鏈所產生，則可以進一步加強ＳＳＲ標記鑒定的可信度。因為只有真雜交種才可能產生雜交鏈，產生了雜交鏈才會出現除雙親互補帶型以外的第三條電泳帶。

參考文獻：

［１］ 李云海，肖晗，張春慶，等．用微衛星ＤＮＡ標記檢測中國主要雜交水稻親本的遺傳差異［Ｊ］．植物學報，１９９９，４１（１０）：１０６１－１０６６．

［２］ 郭慧，李樹杏，徐建第，等． ２４份水稻細胞質雄性不育系的ＳＳＲ多態性分析［Ｊ］．雜交水稻， ２００７，２２（３）：５６－６１．

［３］ 姜樹坤，王政海，鐘鳴，等．遼寧省近十五年部分主栽水稻品種的ＳＳＲ多態性分析［Ｊ］．植物生理學通訊，２００７，４３（１）：６９－７２．

［４］ 李進波，牟同敏，夏建武，等．利用微衛星標記鑒定兩系雜交稻兩優培勝的種子純度［Ｊ］．中國農學通報，２００２，１８（６）：１０－１３．

［５］ 曾大力，錢前，何平，等．利用分子生物學技術鑒別真、假雜交稻的研究［Ｊ］．中國農業科學，１９９９，３２（２）：９３－９６．

［６］ 肖小余，王玉平，張建勇，等． 四川省主要雜交稻親本的ＳＳＲ多態性分析和指紋圖譜的構建與應用［Ｊ］． 中國水稻科學，２００６， ２０（１）：１－７．

［７］ 詹天才．利用微衛星ＤＮＡ標記進行雜交水稻種子純度鑒定的研究［Ｊ］．雜交水稻，２００２，１７（５）：４６－５０．

［８］ 彭鎖堂，莊杰云，顏啟傳，等．我國主要雜交水稻組合及其親本ＳＳＲ標記和純度鑒定［Ｊ］．中國水稻科學，２００３，１７（１）：１－５．

［９］ ＭＵＲＲＡＹ Ｍ Ｇ，ＴＨＯＭＰＳＯＮ Ｗ Ｆ． Ｒａｐｉｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｐｌａｎｔ ＤＮＡ［Ｊ］． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９８０，８（１９）：４３２１－４３２５．

［１０］ 辛業蕓，張展，熊易平，等．應用ＳＳＲ分子標記鑒定超級雜交水稻組合及其純度［Ｊ］．中國水稻科學，２００５，１９（２）：９５－１００．

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