海藻酸鈉固定化鞘氨醇單胞菌對養殖海水COD的降解

摘要：直接用純種菌體在適當條件下培養得到菌體，消除了生物菌體混入雜菌的影響。通過正交試驗得出海藻酸鈉固定化鞘氨醇單細胞小球對ＣＯＤ降解的最佳條件；討論了時間、溫度、ｐＨ值、降解劑用量、搖床搖速幾個單因素對海藻酸鈉固定化鞘氨醇單胞菌小球降解ＣＯＤ的影響；通過比較可以得出在降解ＣＯＤ的過程中，微生物只有借助某一載體才能表現出其最佳降解活性，微生物包埋法具有操作簡單，效果明顯，污染少，成本低等優點。

關鍵詞：降解；海藻酸鈉；固定化；鞘氨醇單胞菌；ＣＯＤ

中圖分類號：Ｘ７１２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）10－1975-05

Study on the COD Degradation of Cultured Seawater in Liangyungang by Sodium Alginate Immobilized Sphingom onas

ＣＨＥＮ Ｗｅｎ－ｂｉｎａ，ｂ，ＹＩＮ Ｌｅｉｂ，ＭＡ Ｗｅｉ－ｘｉｎｇｂ，ＸＵ Ｘｉｎｇ－ｙｏｕｂ，ＫＯＮＧ Ｊｕｎｂ

（a． Ｊｉａｎｇｓｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍａｒｉｎｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ； b．College ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｕａｉｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，

Ｌｉａｎｙｕｎｇａｎｇ ２２２００５， Jiangsu， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｕｓｉｎｇ ｐｕｒｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ｎｅｗ ｔｈａｌｌｉ ｃｏｕｌｄ ｅｌｉｍｉｎａｔｅ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｂａｃｔｅｒｉａ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ immobilized Ｓｐｈｉｎｇｏｍ ｏｎａｓ ｐｅｌｌｅｔ ｔｏ ＣＯＤ degradation ｗａｓ ｅｘｐｌｏｒｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ， ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｓｅｖｅｒａｌ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｔｏ ｔｈｅ ｓｏｄｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｓｐｈｉｎｇｏｍ ｏｎａｓ ｐｅｌｌｅｔ ｔｏ ＣＯＤ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｉｍｅ， ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ｐＨ value， ｔｈｅ degradation reagent dosage ａｎｄ ｔｈｅ ｓｐｅｅｄ ｏｆ ｔｈｅ ｓｈａｋｅｒ ｗｅｒｅ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ． Ｉｔ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｓｈｏｗｅｄ ｈｉｇｈ degradation ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｎｌｙ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ａ ｃｅｒｔａｉｎ ｖｅｃｔｏｒ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ＣＯＤ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ． Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｓｅｖｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＯＤ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ， ｍｉｃｒｏ－ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ ｈａｄ ｍａｎｙ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｓｉｍｐｌｅ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ， ｏｂｖｉｏｕｓ ｅｆｆｅｃｔ， ｌｅｓｓ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ， ｌｏｗ ｃｏｓｔ， ｅｔｃ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ； ｓｏｄｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ； ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ； Ｓｐｈｉｎｇｏｍ ｏｎａｓ； ＣＯＤ

連云港近海海域污水、廢渣、廢油和化學物質源源不斷地流入大海以及海水養殖業的發展使得海水水質惡化，赤潮等海水變質現象的發生讓社會認識到海水修復技術的重要性。海水修復技術有物理修復法、化學修復法和生物修復法等［１］。化學修復法由于投加化學試劑，因此費用高且易產生二次污染［２］。物理修復法易于操作，處理效果明顯，但往往治標不治本［２］。微生物固定化修復技術的主要特點是對完整的微生物細胞進行固定，可避免人為破壞生物酶的活性和生化反應的穩定性，可提高單位體積水體內微生物細胞密度，并可加快細胞的流動速率，能有效地解決污染環境修復問題［３］。固定化后的微生物能長期保持活性，固定化顆粒可重復使用，節省投資，固定化細胞顆粒的微環境有利于屏蔽土著菌、噬菌體和毒性物質對微生物體的惡性競爭、吞噬和毒害，使其在復雜環境中和激烈的操作條件下可穩定地發揮高效性能［４］。將固定化細胞顆粒直接投加到其中，操作簡單，不產生二次污染，節省投資，簡化流程［５］。而有關海水養殖環境生物修復技術的研究，國內外剛剛起步，微生物修復是當前污染環境生物修復的主要形式。于偉君［６］等研究表明光合細菌能降低蝦池水中有害物質、氨氮的含量，對改善蝦池生態環境有明顯的效果。莫照蘭等［７］在實驗室條件下篩選到對蝦池富營養有機物具有較高降解性能的細菌，包括弧屬、假單胞屬、發光桿菌屬等，試驗結果表明這些細菌對消化蝦池殘餌、糞便的處理效果很明顯。研究從海洋底泥中篩選出的鞘氨醇單胞菌菌株ＲＢ２２５６使用海藻酸鈉固定后對污染的養殖海水進行生物修復，對海水中的ＣＯＤ進行降解，通過單因素試驗和正交試驗得出ＣＯＤ的最佳降解條件和各單因素對ＣＯＤ降解影響的大小，可為污染海水的生物修復提供理論依據和實踐參考。

１材料與方法

１．１主要儀器與試劑

ＷＦＪ－７２００型可見分光光度計［尤尼柯（上海）儀器有限公司］；ＴＤＬ－４飛鴿系列離心機（上海安亭科學儀器廠）；ＳＷ－ＣＪ－１Ｄ型無菌操作臺（蘇州凈化設備有限公司）；ｐＨSＪ－５型實驗室ｐＨ計（上海樹立儀器儀表有限公司）；ＳＨＰ－１８０生化培養箱（上海雷磁儀器廠）；ＨＺＱ－ＱＸ型全溫振蕩器（上海實驗儀器總廠）；立式壓力蒸汽滅菌器（哈爾濱東聯電子技術有限公司）。

氯化鈣溶液：２０ ｍｇ／Ｌ，稱取２０ ｇ氯化鈣溶于水中，移入１ ０００ ｍＬ容量瓶內，稀釋至標線，搖勻。

１．２海藻酸鈉固定化鞘氨醇單細胞小球的制備

試驗以連云港贛榆縣某養殖場海水為樣品，此海水樣的初始ＣＯＤ濃度為２０．５0 ｍｇ／Ｌ。

１）配制２％（質量體積分數）海藻酸鈉－鞘氨醇單胞菌混合液（１ ｇ海藻酸鈉加入５０ ｍＬ培養好的菌液）。

２）用注射器吸取海藻酸鈉－鞘氨醇單胞菌混合液，慢慢加入ＣａＣｌ２溶液中，老化４ ｈ。

３）傾去ＣａＣｌ２溶液，用去離子水洗滌海藻酸鈉固定化鞘氨醇單胞菌小球至少３次（以洗滌液中不含Ｃａ２＋為準）。

１．３試驗方法

１．３．１正交試驗設計試驗設計有溫度、小球質量、ｐＨ值、時間４個因素，分別記為Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ，每個因素設４個水平，采用４因素４水平的正交表將試驗分為１６個處理組，其中Ａ１． ３７ ℃、Ａ２．３０ ℃、Ａ３．２０ ℃、Ａ４．１０ ℃；Ｂ１．０．９ ｇ、 Ｂ２．１．０ ｇ、 Ｂ３．１．１ ｇ、 Ｂ４． １．２ ｇ；Ｃ１． ｐＨ值４、Ｃ２． ｐＨ值５、Ｃ３． ｐＨ值６、Ｃ４． ｐＨ值７；Ｄ１． ９０ ｍｉｎ、Ｄ２．１００ ｍｉｎ、Ｄ３．１１０ ｍｉｎ、Ｄ４．１２０ ｍｉｎ，每處理３次重復。海水樣品為10 mL。

１．３．２單因素試驗分別考察了溫度、小球質量、ｐＨ值、時間、搖床轉速對海藻酸鈉固定化鞘氨醇單胞菌小球降解ＣＯＤ的影響。

１．３．３比較試驗考察了鞘氨醇單胞菌包埋與否對ＣＯＤ降解的影響。

１．３．４試驗步驟用所取海水水樣調節不同ｐＨ值，加入降解劑海藻酸鈉固定化鞘氨醇單胞菌小球，至上述Ａ因素中不同溫度的搖床中，振蕩Ｄ因素中的不同時間，待振蕩時間結束，過濾，測降解后海水中的ＣＯＤ。

２結果與分析

２．１正交試驗結果與分析

由測得的降解后海水ＣＯＤ的值計算出降解劑的降解量和降解率，其數據見表１。由表１可以看出，降解量中極差最大的是Ｃ，其次是Ｄ、Ａ、Ｂ，說明ｐＨ值對降解量的影響最大；再得出降解率中的極差大小與降解量的順序一致，也是Ｃ＞Ｄ＞Ａ＞Ｂ，說明ｐＨ值對降解率的影響最大。吸附率的方差分析如表２。由表２可知，因素Ａ、Ｃ、Ｄ對吸附率的影響極顯著，結合表１各因素對吸附率影響的主次順序為Ｃ＞Ｄ＞Ａ＞Ｂ，則最優方案為Ｃ３Ｄ１Ａ１Ｂ１，即在ｐＨ值為６，振蕩９０ ｍｉｎ，３７℃，小球質量為０．９ ｇ時吸附效果最佳。吸附量的方差分析如表３。由表３可知，因素Ａ、Ｃ、Ｄ對吸附量的影響極顯著，結合表１各因素對吸附量影響的主次順序Ｃ＞Ｄ＞Ａ＞Ｂ，則最優方案為Ｃ３Ｄ１Ａ１Ｂ４，即在ｐＨ值為６，振蕩９０ ｍｉｎ，３７℃，小球質量１．２ ｇ時吸附效果最佳。

２．２ 單因素試驗結果分析

２．２．１時間、溫度與降解量之間的關系試驗中時間試驗擬定靜置與振蕩兩種情況，取５個２５ ｍＬ錐形瓶向其中加１０ ｍＬ海水，再向其中加入１．０ ｇ降解劑，在３７℃水浴中不同時間測ＣＯＤ，其結果見圖１。從圖１中看出，兩種情況下以振蕩時降解效果最佳，主要是由于振蕩時整個溶液內還原性物質是均勻分布的，降解速度均勻；靜置時小球降解還原性物質是呈局部狀態的，速度時快時慢。開始時降解速度較快，接下來降解速度相對變慢，到最后還出現降解量下降的現象。這主要是由于起初小球內部積累的還原性物質濃度較低，隨時間變化，小球內部還原性物質的濃度增大，使降解速率減小［８］，當降解量達到最大后，小球內部的還原性物質被解析出來，降解量出現下降的現象。由圖２可以看出，在相同的時間內，溫度越高，降解量就越大，這主要是由于降解反應是一個吸熱過程，溫度越高，越有利于降解的進行。但是超過一定溫度后，降解效果變差，主要是由于微生物的活性是在一定溫度下表現出來的，超過或低于此溫度酶的活性降低，小球的降解率性能下降［９，１０］，降解效果達不到最佳。

２．２．２降解劑量、ｐＨ值對降解性能的影響由圖３可以看出，增加降解劑的量可以提高降解性能，但加入過多也會降低降解性能。原因是由于降解劑的解析作用；另一方面是由于降解體系中溶質與溶劑相互作用，從而使降解性能下降［５］。

從圖４中可以看出，當ｐＨ值為７左右時降解效果較佳。隨著ｐＨ值的增大，降解性能呈現下降的趨勢，這可能是由于在較強酸的條件下，Ｈ＋的濃度較大，結合了細菌表面的負電荷，使降解劑表面的負電荷減少，從而使其降解還原性物質的能力減小，因此其降解性能也差。另外，微生物只有在最佳ｐＨ值下，其體內的酶活性最大，ｐＨ值或高或低都會影響酶的活性，因此不在最佳ｐＨ值下時，酶的活性降低，降解性能也會下降［１１，１２］。

２．２．３搖床轉速、不同生長時期細菌對降解性能的影響由圖５看出，隨轉速增加，降解量和降解率先增加后減少，因為改變轉速影響溶氧和水中微生物的接觸情況。低轉速會導致供氧不足，限制微生物對還原性物質的去除，使水與微生物不能充分接觸；提高轉速會導致微生物之間的摩擦增加，造成微生物磨損，不易降解還原性物質［１３］。

由圖６可知，培養２４ ｈ的微生物做成的小球的降解量與降解率最大。這是由于培養２４ ｈ的微生物正處于活性最強的對數期，而選用的其他培養時間的微生物處于微生物生長繁殖的其他３個時期，其活性不如對數期，因此，選用培養２４ ｈ的微生物做成小球的降解量與降解率比選用其他培養時間的大［１０］。

由此可見，對ＣＯＤ降解起主要作用的還是微生物，海藻酸鈉作為一種天然高分子物質具有生物降解性和生物相容性，由于其結構中含有降解性官能團，其對ＣＯＤ降解起一定的作用［１４］。微生物降解ＣＯＤ的機理可能分為兩個階段：第一階段與代謝無關，為生物降解過程，在此過程中，水樣中的還原性物質可能通過配位、螯合、離子交換、物理降解及微沉淀等作用中的一種或幾種復合至細胞表面。在此階段中微生物的作用較快；第二階段為生物累積過程，在此階段中還原性物質被運送至細胞內。生物累積過程和細胞代謝直接相關［１４，１５］。

綜上所述，在３７℃、１．０ ｇ降解劑、ｐＨ值為7左右、振蕩時間9０ ｍｉｎ、搖床轉速１１５ ｒ／ｍｉｎ時，效果較佳。達到國家規定海水質量標準中的二類海水水質標準，符合養殖海水標準（清潔海水ＣＯＤ≤２ ｍｇ／Ｌ，較清潔海水ＣＯＤ≤３ ｍｇ／Ｌ，輕微污染海水ＣＯＤ≤４ ｍｇ／Ｌ，中度污染海水ＣＯＤ≤５ ｍｇ／Ｌ）。

３結論

通過海藻酸鈉固定化鞘氨醇單胞菌對海水ＣＯＤ降解的試驗，在搖床轉速、溫度、ｐＨ值、降解劑質量因素中，ｐＨ值對海水ＣＯＤ降解的影響最大。其中，溫度是一個較主要的因素。由于降解反應是一個化學過程，所以降解量和降解率會隨著溫度的升高而增大；ｐＨ值同樣也是一個影響因素，試驗中降解量和降解率隨著ｐＨ值的升高先升后降，一般ｐＨ值為7左右，降解效果較佳；培養24 h的微生物做成的小球降解效果最好。處理后的海水達到國家規定海水質量標準中的二類海水水質標準，符合養殖海水標準。

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