浸種催芽對打破云南紅豆杉種子休眠的初步研究

摘要：以云南紅豆杉（Ｔａｘｕｓ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ Ｃｈｅｎｇ ｅｔ Ｌ．Ｋ．Ｆｕ）種子為研究對象，將種子浸種催芽處理后在基本培養基上培養，探索能有效解除種胚休眠時間過長的途徑。結果顯示，云南紅豆杉種子具有內生菌；離體培養條件下種子較易形成愈傷組織，表明種子有足夠的內源激素；盡管各浸種方法均不能有效打破種子休眠、促進萌發，但發現細胞分裂素有促進愈傷組織形成的作用，赤霉素處理比清水處理的萌發率略高，這說明單一激素處理不能有效地解除種子休眠，可進一步做激素之間的交互作用以及對激素應答方面的研究。

關鍵詞：云南紅豆杉；種子；浸種催芽；離體培養

中圖分類號：Ｓ５６７．１＋９；Ｑ９４９．６６＋１；Ｓ５０４．１文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）10－2057-03

Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｓｅｅｄ Ｄｏｒｍａｎｃｙ Breaking Effect of Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ｓｏａｋｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ on Ｔａｘｕｓ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ

ＹＡＮＧ Ｌｉｎｇ，ＣＨＥＮ Ｈｕ－ｇｅｎｇ，ＮＩＵ Ｚｕ－ｌｉｎ，ＳＨＩ Ｗｅｎ－ｙａ

（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｆｏｒｅｓｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｍｏｕｎｔａｉｎｓ ｏｆ Ｃｈｉｎａ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｏｉｎ， Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２２４， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Tｈｅ ｓｅｅｄｓ ｏｆ Ｔａｘｕｓ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ Ｃｈｅｎｇ ｅｔ Ｌ．Ｋ．Ｆｕ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｓｅｅｄ ｄｏｒｍａｎｃｙ ｂｙ ｓｏａｋｉｎｇ ｓｅｅｄｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ that ｓｏｍｅ eｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｂａｃｔｅｒｉａ ｅｘｉｓｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｅｄｓ ｏｆ Ｔ． ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ； ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｓｅｅｄｓ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｄｕｃｅ ｃａｌｌｕｓ ｅａｓｉｌｙ which ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ were ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｇｒｏｗｔｈ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ． Ｃｙｔｏｋｉｎｉｎｓ ｈａｄ ａ ｌｉｔｔｌｅ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ effect on ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｌｕｓ ｔｈｏｕｇｈ no soaking ｍｅｔｈｏｄｓ ｃｏｕｌｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｄｏｒｍａｎｃｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ； ａｎｄ gｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ ｈａｄ ｓｌｉｇｈｔ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ increasing ｔｈｅ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｅｄｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ single treatmeat of any ｇｒｏｗｔｈ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｃｏｕｌｄnot ｒｅｌｅａｓｅ ｔｈｅ ｄｏｒｍａｎｃｙ ｏｆ Ｔ． ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ ｓｅｅｄｓ effectively； ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｔｏ ｆｉｎｄ ｏｕｔ ｔｈｅ ａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ.

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｔａｘｕｓ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ Ｃｈｅｎｇ ｅｔ Ｌ．Ｋ．Ｆｕ； ｓｅｅｄ； ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｏａｋｉｎｇ； ｉｎ ｖｉｔｒｏ

云南紅豆杉（Ｔａｘｕｓ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ Ｃｈｅｎｇ ｅｔ Ｌ．Ｋ．Ｆｕ）為國家一級保護植物，不僅是珍貴的用材樹種，而且其枝葉、樹皮中含有紫杉醇（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）等抗癌活性物質，是國產紅豆杉中紫杉醇等抗癌活性物質含量較高的樹種，具有很高的藥用開發價值［１］。對抗癌藥物紫杉醇的開發引發了對該種植物天然資源的掠奪性破壞，為保護紅豆杉這一珍貴物種資源，保證紫杉醇的充足穩定均衡供應，應積極培育云南紅豆杉人工林資源。利用種子繁育發展人工林是一條最直接的途徑，云南紅豆杉的實生苗具有根系發達、主干直立、不偏冠、生物量大、抗逆性強等優點，適宜于大規模山地種植。但由于云南紅豆杉種子的休眠期較長，在自然條件下需要兩冬一夏才能萌發，大量的種子在漫長的休眠期內往往會喪失生命力，從而限制了對該資源的利用［２］。如何解除種子休眠、縮短育苗周期、提高種子繁殖能力，成為云南紅豆杉種苗培育中亟待解決的問題。

自２０世紀７０年代以來，研究人員相繼展開了對歐洲紅豆杉（Ｔａｘｕｓ ｂａｃｃａｔａ Ｌ．）、雜種紅豆杉（Ｔａｘｕｓ ｍｅｄｉａ Ｒｅｈｄ．）、短葉紅豆杉（Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ Ｎｕｔｔ．）等的胚離體培養研究，但試驗結果非常有限。１９９１年，Ｆｌｏｒｅｓ等［３］報道，從雜種紅豆杉、短葉紅豆杉綠色種子中剝取的未成熟胚接種在Ｗｈｉｔｅ或ＭＳ培養基上，其萌發率最高可達７０％，而且種子越成熟，其培養胚的萌發率越低。１９９４年，Ｚｈｉｒｉ等［４］報道了一種簡便的方法，可以打破歐洲紅豆杉某一栽培品種種子的休眠，使其離體胚快速萌發。１９９８年，梅興國等［５］采用Ｂ５與ＭＳ相結合的ＢＭ培養基以及適宜濃度的激素，解除了南方紅豆杉（Ｔａｘｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｖａｒ．ｍａｉｒｅｉ Ｃｈｅｎｇ ｅｔ Ｌ．Ｋ）離體胚的休眠，使其胚萌發率達到了８１％，后將培養物轉入成苗培養基上，形成了健壯完整的種苗。Ｆｌｏｒｅｓ等［３］在Ｗｈｉｔｅ培養基上培養短葉紅豆杉離體胚時，發現胚萌發率隨著成熟度的增加而顯著降低，而Ｃｈｅｅ在Ｂ５培養基上培養短葉紅豆杉離體胚的結果正好相反［６］，這可能是成熟胚與未成熟胚各自適宜的培養基不同所導致的。對云南紅豆杉離體胚培養方面僅有趙沛基等［７］做過的一些試驗，但成苗率較低，離實際應用還有很長的距離。試驗以云南紅豆杉種子為研究對象，通過不同種子浸種催芽方法，摸索能有效解除胚休眠時間長的途徑；并且在離體培養中應用不同培養基和培養方法誘導胚的萌發，現將結果報告如下。

１材料與方法

１．１材料

試驗所用云南紅豆杉種子采自云南省楚雄州一平浪林場，采取假種皮已變紅的種子，去除肉質假種皮，晾干后帶回實驗室，與濕沙混拌，保存于４℃冰箱中，隨用隨取。

１．２試驗方法

１．２．１處理和浸種將種子用洗衣粉在自來水下充分清洗后，對種皮分別采用兩種方式處理。一是對種皮不處理；二是剝去堅硬的外種皮和中種皮。然后分別用以下處理方法進行浸種，并且都為室溫過夜，每處理的每一個濃度都為３次重復。①溫水浸種，將種子放入４５ ℃溫水中不停攪拌至室溫，繼續浸泡；②赤霉素溶液浸種，溶液濃度分別為５０、１００、３００ ｍｇ／Ｌ；③細胞分裂素（６－ＢＡ）溶液浸種，溶液濃度分別為１、２、３ ｍｇ／Ｌ；④清水浸種（對照）。

１．２．２消毒與接種將處理好的種子（仁）用０．１％升汞溶液表面消毒并充分清洗后，接種到培養基上，均勻擺放。培養基有ＭＳ和Ｂ５兩種，３次重復，置于２５℃±２℃下培養，先暗培養１個月，然后轉移到光照條件下每天光照１０ ｈ，光強１ ５００ ｌｘ。繼代為每個月一次，將培養物轉移至新鮮的培養基上，繼續培養。種子萌發指長出胚軸和胚根，幼苗指完整長出子葉、胚軸和胚根的小苗。萌發率=萌發數 / 接種數×100%，出愈率=愈傷產生數/接種數×100%。

２結果與分析

２．１種皮對種子培養的影響

種皮處理對云南紅豆杉種子培養的影響結果見表１，從表１可見，接種時，如果帶上種皮，則操作容易，但同時污染率極高；有的培養物甚至在培養３周后才開始出現污染。如果去除種皮（連同內種皮），盡管會增加操作難度，但取得了良好的控制污染效果。而且在相同的培養時間內，去除種皮的種仁在外觀上均有變化，有些胚乳有愈傷組織產生，有些胚開始萌動；但保留種皮的種子則沒有變化，具體見圖１。從這些現象可初步推測，在云南紅豆杉的各層種皮間可能存在著內生菌；同時也說明，種皮的存在抑制了種子的萌動。

２．２浸種方法對萌發率的影響

浸種方法對云南紅豆杉種子離體培養萌發率的影響結果見表２，從表２可見，溫水浸種、６－ＢＡ溶液浸種不能起到打破休眠和促進萌發的作用，但經６－ＢＡ溶液處理后的種子在愈傷組織產生的數量上要多一些，這說明在云南紅豆杉種子離體培養時，細胞分裂素促進細胞分裂的作用明顯大于打破休眠的作用。赤霉素溶液處理后的萌發率稍高于對照，但兩者差異仍不明顯，而且不同的濃度間表現出萌發率沒有規律性的變化，這說明３００ ｍｇ／Ｌ濃度以下的赤霉素不能有效地打破云南紅豆杉種子的休眠狀態。

另外在試驗中，除了種子正常萌發外，還發現多數種子的胚乳愈傷化，胚乳膨大并裂開，有的裂開處可見增大的胚，具體見圖２。但使用的培養基中均未人為添加植物激素，這說明種子本身含有足夠的內源激素。膨大后露出胚的培養物，隨著培養時間的延長，其胚軸和胚根并未繼續伸長，而是也出現了愈傷組織；當培養時間延長到２～３個月后，愈傷組織的顏色發生變化，由白色或淺黃色變紅色或紫色，最終為褐色，多次繼代后愈傷組織的顏色也越來越深，個中原因可能與云南紅豆杉種子中存在抑制物質有關。

２．３不同培養基對萌發率的影響

在ＭＳ和Ｂ５兩種培養基上，云南紅豆杉種子（仁）的萌發情況見表３，顯而易見，在ＭＳ和Ｂ５兩種培養基上的種子萌發率差異不明顯。而且觀察發現到一個有規律的現象，如果胚乳膨大并開裂的，則其中的胚均不能正常生長成為幼苗，而是隨著培養時間的延長，整個外植體都愈傷化；但如果種仁增大而未開裂，在其一端伸出胚根的，則能長出幼苗（圖３）。不過幼苗在ＭＳ和Ｂ５培養基上卻不能繼續生長發育，隨著培養時間的延長，胚乳干枯后，幼苗逐漸褐化，最終變褐死亡（圖４）。

３小結與討論

１）試驗表明，云南紅豆杉種子中存在著內生菌，在帶種皮無菌培養時雜菌大量生長，使種子不能萌發。有研究顯示，云南紅豆杉的根、莖、葉等部位都有內生菌生存［８］；云南紅豆杉種子通過層積處理后［９，１０］，種子萌發效果良好，但對于層積過程中到底是由于什么樣的變化導致這一結果，卻并未有人做深入的研究來解釋。是由于種子內對細胞有毒害作用的物質（如紫杉烷類二萜化合物［１１］）基本消除了，還是激素平衡發生什么變化，這些變化與種子中的內生菌有無關聯，等等。因條件有限，試驗未能就這一問題進行深入探討。

２）云南紅豆杉種子萌發后在培養基上成苗難。試驗中盡管也有少量種子萌發后得到了形態正常的幼苗，但似乎無菌的環境卻不利于幼苗的繼續生長，表現為幼苗在子葉張開、胚乳干枯后、胚根未能繼續發育，而后幼苗逐漸褐化，最終變褐死亡。根據前述分析，可進一步推測種皮中的內生菌與云南紅豆杉幼苗生長有著密切的關系。

３）溫水浸種處理對打破種子休眠沒有任何作用。細胞分裂素能打破其他物種的種子休眠［１２］，但在本研究中，云南紅豆杉種子經細胞分裂素處理后卻只能誘導更多的愈傷組織形成，而且具有解除種子休眠和促進萌發作用的赤霉素對云南紅豆杉種子的作用也微乎其微。分析其原因，可能是試驗采用的是單一激素處理，而在云南紅豆杉種子休眠和萌發過程中關于激素間的相互作用以及激素對環境的應答方面目前并沒有相關的研究報道，加之云南紅豆杉種子本身含有足夠的內源激素（這可以從種仁離體培養時極易產生愈傷組織的現象得以證實），是否與外源激素形成頡頏也不得而知。因此，哪種或哪幾種激素組合達到什么樣的平衡才能打破種子的休眠仍不是很清楚，今后可對此展開系統試驗以探索其機理。

４）試驗得到的云南紅豆杉種子萌發率都比較低，這與趙沛基等［７］高達８６％的研究結果不同，分析其原因，一方面是由于試驗用云南紅豆杉種子為一次性采集種子，然后低溫貯藏進行連續的試驗研究，或許是保存時間的增加降低了種子的萌發率；另一方面，在云南紅豆杉成熟種子中，具有胚發育程度的差異［１３］，這也有可能導致種子出現萌發率低的現象。

參考文獻：

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