復(fù)方中藥提取物抗白色念珠菌活性及其主要成分

摘要：研究由苦參、土茯苓和白鮮皮組成的復(fù)方中藥提取物的抗白色念珠菌活性及主要成分。采用肉湯微量稀釋法，測定復(fù)方中藥提取物對白色念珠菌的抗菌活性，并采用化學(xué)方法對中藥復(fù)方提取液進行成分預(yù)試。結(jié)果顯示，提取物具明顯的抑制白色念珠菌生長的活性；經(jīng)理化鑒別試驗顯示，該復(fù)方提取物主要含有多糖、黃酮、生物堿三大類成分。表明多糖、黃酮和生物堿這三大類成分可能是復(fù)方提取物發(fā)揮抗白色念珠菌活性的重要成分，但確定其發(fā)揮作用的具體成分還需進一步的研究。

關(guān)鍵詞：復(fù)方中藥；白色念珠菌；苦參；土茯苓；白鮮皮

中圖分類號：Ｒ２８５．５文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）10－2000-03

Study on Anti-Candida albicans Activity and Major Components of Compound

Chinese Medicine Extracts

ＺＨＡＮＧ Ｃｈａｏ１，２，ＬＥＩ Ｃｈｕｎ－ｊｕａｎ３，ＷＥＩ Ｑｉｎ１，ＹＩＮ Ｚｈｏｎｇ－ｑｉｏｎｇ３，ＺＨＯＵ Ｌｉ－ｊｕｎ１，２，ＹＩＮ Ｌｉ－ｇｕｏ１，２

（１.Ｋｅｙ Ｌａｂ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｉｇｈｅｒ Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｙｉｂｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙｉｂｉｎ ６４４０００，Ｓｉcｈｕａｎ，Ｃhｉｎａ；

２.Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｙｉｂｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｙｉｂｉｎ ６４４０００，Ｓｉcｈｕａｎ，Ｃhｉｎａ；

３.Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｓｉｃｈｕａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｙａａｎ ６２５０１４，Ｓｉcｈｕａｎ，Ｃhｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： The anti－Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｍａｊｏｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄ Chinese Medicine ｅｘｔｒａｃｔｓ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ Ｓｏｐｈｏｒａ fｌａｖｅｓｃｅｎｓ， Ｓｍｉｌａx ｇｌａｂｒａ ａｎｄ Ｃｏｒｔｅｘ dｉｃｔａｍｎｉ ｗｅｒｅ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｄ. Ｔｈｅ ｂｒｏｔｈ ｍｉｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ aｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｔｏ Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ． Ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｅｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｂｙ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｈａｄ ｏｂｖｉｏｕｓ ａｎｔｉ－Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ａｎｄ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ， ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ａｎｄ ａｌｋａｌｏｉｄｓ were ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｅｘｔｒａｃｔｓ． Ｉｔ＇ｓ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ were ｔｈｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｅｘｅｒｔｉｎｇ ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｈｏｗｅｖｅｒ， ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｃｒｅｔｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｓｔｉｌｌ ｎｅｅｄed ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ； Candida albicans； Ｓｏｐｈｏｒａ fｌａｖｅｓｃｅｎｓ； Ｓｍｉｌａx ｇｌａｂｒａ； Ｃｏｒｔｅｘ dｉｃｔａｍｎｉ

白色念珠菌（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）是機會致病菌，可致人和動物念珠菌病［１］。近年來，其感染率不斷上升［２］，且耐藥菌株亦逐年增多。而現(xiàn)有治療藥物存在易產(chǎn)生毒副反應(yīng)、過敏反應(yīng)等缺點。中藥材制劑因具有高效低毒、且不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，從中尋找新型抗白色念珠菌藥物成為研究的新趨勢［３］。

苦參（Ｒａｄｉｘ Ｓｏｐｈｏｒａｅ Ｆｌａｖｅｓｃｅｎｔｉｓ，ＲＳＦ）、土茯苓（Ｒｈｉｚｏｍｅ Ｓｍｉｌａｃｉｓ Ｇｌａｂｒａｅ，ＲＳＧ）及白鮮皮（Ｃｏｒｔｅｘ Ｄｉｃｔａｍｎｉ，ＣＤ）為傳統(tǒng)中藥材。近年的研究表明，苦參對細菌及多種皮膚真菌有不同程度的抑制作用［４－７］。土茯苓抑菌范圍廣，活性強，是重要的抗細菌藥

物［８－９］。而白鮮皮為中醫(yī)皮膚科常用藥物，對部分皮膚真菌及白色念珠菌、金色葡萄球菌等均有一定的抑菌作用［１０－１２］。本研究對這３種中藥材的復(fù)方中藥提取物進行了藥敏試驗，觀察其對白色念珠菌的抑菌效果，并對提取物進行了成分預(yù)試。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１中藥材苦參、土茯苓、白鮮皮。

１．１．２供試菌種白色念珠菌，由宜賓學(xué)院發(fā)酵資源與應(yīng)用四川省高校重點實驗室提供。

１．１．３試劑及培養(yǎng)基所用試劑均為分析純，購于成都市科龍化工試劑廠；ＲＰＭＩ１６４０，購于Ｇｉｂｃｏ公司；ＭＯＰＳ，購于Ａｍｒｅｓｃｏ公司。

１．２方法

１．２．１提取物的提取苦參、土茯苓、白鮮皮分別粉碎，質(zhì)量比２∶２∶１混勻，入抽提瓶內(nèi)，加７０％的乙醇進行回流提取。溫度８０ ℃（微沸狀態(tài)），固液比１∶１０。提取２次，合并２次提取液，抽濾后濃縮成浸膏。計算浸膏得率。

１．２．２復(fù)方中藥對白色念珠菌的體外抑菌活性測定藥敏試驗參照ＮＣＣＬＳ修訂的Ｍ２７－Ａ２［１３］，ＲＰＭＩ １６４０培養(yǎng)基按參考文獻［１３］制備。

１）菌懸液的制備。挑取沙氏培養(yǎng)基上至少轉(zhuǎn)種２次的白色念珠菌菌落于生理鹽水中，制成菌懸液，并調(diào)整其濃度至約為１０６ ＣＦＵ／ｍＬ，備用。試驗前用ＲＰＭＩ１６４０液體培養(yǎng)基稀釋１ ０００倍（約為１０３ ＣＦＵ／ｍＬ）后使用。

２）抗菌藥液的制備。精密稱量０．５０ ｇ浸膏溶于１ ｍＬ無菌水中，超聲波振蕩１０ ｍｉｎ，配制成濃度為０．５０ ｇ／ｍＬ的貯存藥液。取貯存藥液０．５０ ｍＬ加入４．５0 ｍＬ ＲＰＭＩ１６４０培養(yǎng)液配成工作液，工作液濃度為５０．０ ｍｇ／ｍＬ。

３）試驗操作。在無菌９６孔微量板每排的第一、二孔加入１００ μＬ工作液，每排從第二至第九孔均加入１００ μＬ培養(yǎng)液，并按兩倍稀釋法進行工作液逐步稀釋，配制成濃度分別為５０．０～０．１９５ ｍｇ／ｍＬ的溶液。每個濃度做３個平行孔。每排第十孔作為對照，即加入２０ μＬ無菌水和８０ μＬ培養(yǎng)液。每排第十一、十二孔分別作培養(yǎng)液空白對照和真菌生長陽性對照，均加入１００ μＬ培養(yǎng)液。每排的第一至第九孔和第十、第十二孔再加入１００ μＬ菌液（１０３ ＣＦＵ／ｍＬ），最終藥物濃度為２５．０～０．０９８ ｍｇ／ｍＬ。將微量板加蓋后置于３７℃孵育２４ ｈ。然后進行結(jié)果判定。

４）結(jié)果判定。將測試孔菌株生長情況與對照孔進行比較，以培養(yǎng)液清澈為陰性，記為沒有菌落生長；混濁有菌膜為陽性，記為有菌落生長。以培養(yǎng)液清澈的最小濃度作為該藥的最低抑菌濃度（ＭＩＣ）。

１．２．３復(fù)方中藥提取物的化學(xué)成分預(yù)試采用化學(xué)方法對中藥復(fù)方提取液進行了成分預(yù)試［１４］，為制劑的質(zhì)量標準的建立奠定基礎(chǔ)。按１．２．１的方法制得的提取液，進行主要已知殺菌成分預(yù)試驗，包括皂苷、糖類、酚類、黃酮類、生物堿、蒽醌。

１）皂苷的鑒別。①泡沫試驗：取樣品溶液２ ｍＬ于帶塞試管中，用力振搖３ ｍｉｎ，檢查是否產(chǎn)生持久性蜂窩狀泡沫（維持１０ ｍｉｎ以上），且泡沫量不少于液體體積的１／３。②醋酐濃硫酸試驗（Ｌｉｅｂｒｍａｎｎ Ｂｕｒｃｈａｒｄ反應(yīng)）：取樣品溶液置蒸發(fā)皿中，于水浴上蒸干，殘渣加入少量冰醋酸使溶解，再加入醋酐濃硫酸（１９∶１）試液，檢查是否呈現(xiàn)紅紫色并變成污綠色（甾類、三萜類成分或皂甙）。

２）糖類的鑒別。①斐林試劑試驗：取樣品溶液２ ｍＬ，加入堿性酒石酸銅試液１ ｍＬ，沸水浴加熱５ ｍｉｎ，觀察是否產(chǎn)生棕紅色或磚紅色氧化亞銅沉淀。②Ｍｏｌｉｓｈ反應(yīng)：取樣品溶液１ ｍＬ，加５％萘酚試液數(shù)滴振搖后，沿管壁滴入５滴濃硫酸，使其成兩液層，待３ ｍｉｎ后，觀察兩層液面間是否出現(xiàn)紫紅色環(huán)。③碘試驗：取樣品溶液１ ｍＬ，加碘試液，觀察顏色變化，是否顯藍色或紫紅色（檢查淀粉及糊精）。

３）酚類的鑒別。①溴試驗：取樣品溶液１ ｍＬ，加溴試液２滴，觀察現(xiàn)象，若變成白色或生成沉淀物，則可能含有酚或兒茶酚鞣質(zhì)。②香草醛－酸試驗：取樣品溶液點于濾紙片上，干后，噴霧或滴加香草醛－鹽酸試劑，觀察變化。

４）黃酮類的鑒別。①鹽酸－鎂粉反應(yīng)：取樣品溶液１ ｍＬ，加放少量鎂粉（或鋅粉），然后加濃鹽酸４滴，沸水浴加熱２ ｍｉｎ，如出現(xiàn)紅色則有游離黃酮或黃酮甙。并以同法不加鎂粉或鋅粉的作對照，如兩管都顯紅色則有花色素存在。②三氯化鋁熒光試驗：在樣品溶液中加入幾滴１％三氯化鋁乙醇液，在紫外光燈下觀察是否有黃綠色熒光。③濃氨水反應(yīng)：向樣品溶液中加入幾滴濃氨水，觀察是否有亮黃色或橙色反應(yīng)。④鉛鹽反應(yīng)：將１％的乙酸鉛加入樣品溶液中，觀察是否有黃色至紅色沉淀產(chǎn)生。

５）生物堿的鑒別。沉淀反應(yīng)：分別向樣品溶液中加入碘化鉍鉀試劑、硅鎢酸試劑及磷鉬酸試劑，觀察是否有沉淀產(chǎn)生及顏色變化。

６）蒽醌的鑒別。①堿液反應(yīng)：取樣品溶液１ ｍＬ，向其中加入１０％氫氧化鈉２滴、雙氧水２滴，加入適量稀鹽酸，觀察溶液變化情況。②醋酸鎂反應(yīng)：取樣品溶液１ ｍＬ，向其中加入１％醋酸鎂溶液２滴，觀察溶液變化情況。

２試驗結(jié)果

２．１復(fù)方中藥提取物得率及其ＭＩＣ

經(jīng)計算，復(fù)方中藥材提取物得率約為２３％；對白色念珠菌ＭＩＣ值為０．１９５ ｍｇ／ｍＬ。

２．２皂苷的鑒別

經(jīng)泡沫試驗，樣品溶液無泡沫產(chǎn)生；經(jīng)醋酐濃硫酸試驗后樣品溶液顏色無變化。

２．３糖類的鑒別

由圖１可見，①Ｍｏｌｉｓｈ反應(yīng)，溶液液面出現(xiàn)紫紅色環(huán)。②斐林試劑試驗，溶液中產(chǎn)生磚紅色沉淀。③碘試驗，溶液不顯藍色或紫紅色。由這三種結(jié)果可知，中藥提取物中含有不是淀粉和糊精的多糖類成分。

２．４酚類的鑒別

經(jīng)溴試驗，樣品溶液無沉淀反應(yīng)或顏色變化；經(jīng)香草醛－鹽酸試驗，樣品顏色無變化。

２．５黃酮類的鑒別

試驗結(jié)果見圖２，①鹽酸－鎂粉反應(yīng)兩管都顯紅色。②三氯化鋁熒光試驗在紫外光燈下觀察有黃綠色熒光。③鉛鹽反應(yīng)，反應(yīng)后溶液中有淺黃色沉淀產(chǎn)生。④濃氨水反應(yīng)溶液變?yōu)槌壬?/p>

２．６生物堿的鑒別

由圖３可見，①加磷鉬酸試劑，溶液中產(chǎn)生白色沉淀。②加碘化鉍鉀試劑，反應(yīng)后溶液中產(chǎn)生橘紅色沉淀。③加硅鎢酸試劑，溶液中產(chǎn)生淺黃色沉淀。

２．７蒽醌的鑒別

堿液反應(yīng)和醋酸鎂反應(yīng)，樣品溶液顏色均無變化。

３結(jié)果與討論

本試驗抑菌結(jié)果表明，由苦參、土茯苓及白鮮皮組成的復(fù)方中藥提取物對白色念珠菌有顯著抑制作用。0.１９５ mｇ／ｍＬ的ＭＩＣ值低于白鮮堿對白色念珠菌的ＭＩＣ值［１５］，說明以白鮮皮為組成成分的復(fù)方中藥材提取物對白色念珠菌的抑菌效果優(yōu)于單方的白鮮堿，也反映出復(fù)方提取物有更好的抑菌效果。成分預(yù)試發(fā)現(xiàn)，該提取物中主要含有多糖、黃酮及生物堿類成分。現(xiàn)代藥理研究表明，苦參發(fā)揮抑菌作用的主要活性成分是苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿、三葉豆檀甙和高麗槐素［１６］。土茯苓化學(xué)成分主要為黃酮類、皂甙、多糖，有藥理作用的物質(zhì)主要為黃酮類成分［１７］。白鮮皮主要化學(xué)活性成分為生物堿類、黃酮類及檸檬苦素類物質(zhì)，已有研究表明其中所含的梣皮酮和白鮮堿是其主要殺菌活性成分［１８］。該提取物對白色念珠菌的抑菌活性有可能是幾類成分的協(xié)同作用導(dǎo)致。這一結(jié)果與現(xiàn)代藥理研究相符。

參考文獻：

［１］ 陸承平．獸醫(yī)微生物學(xué)［Ｍ］．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，２００５．

［２］ 賈杰．現(xiàn)代真菌病學(xué)［Ｍ］．鄭州：鄭州大學(xué)出版社，２００１．

［３］ 廣州時每醫(yī)藥信息有限公司． ２００５年抗真菌藥物市場研究報告［Ｒ］． ２００５．

［４］ 鄭津輝，王威，黃輝，等．苦參提取液中黃酮類化合物的抑菌作用［Ｊ］． 武漢大學(xué)學(xué)報（理學(xué)版），２００８，５４（４）：４３９－４３２．

［５］ 湯長明，李軍，龐曉東，等． 雷公藤與苦參配伍的體外抑菌試驗［Ｊ］． 實用醫(yī)藥雜志，２００３，２０ （２）：１５８．

［６］ 樊宏偉，盧繼紅，張蓉，等．苦參堿類生物堿的體外抑菌、抑病毒及誘生干擾素的實驗研究［Ｊ］． 醫(yī)藥信息，２０００（４）：７５－７６．

［７］ 邸大琳，李法慶，陳蕾，等．苦參體外抑菌作用的研究［Ｊ］．時珍國醫(yī)國藥， ２００６，１７（１０）：１９７４．

［８］ 王志強，邱世翠，宋海英，等． 土茯苓體外抑菌作用研究［Ｊ］．時珍國醫(yī)國藥，２００６，１７（１１）： ２２０３－２２０４．

［９］ 紀莉蓮，范怡梅．土茯苓體外抗菌活性實驗［Ｊ］．中國生化藥物雜志，２００２，２３（５）：２３９－２４１．

［１０］ 武海燕．藥用植物白鮮皮的化學(xué)成分及藥理作用綜述［Ｊ］．內(nèi)蒙古石油化工，２００７（３）：５０－５１．

［１１］ 郭靜，張毅．白鮮皮復(fù)方臨床應(yīng)用集萃［Ｊ］．中醫(yī)藥學(xué)刊，２００５，２３（３）：５１３－５１４．

［１２］ 江霞．復(fù)方白鮮皮洗劑抗菌實驗［Ｊ］．中國藥師，２００５，８（４）：３４５－３４６．

［１３］ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｓｔａｎｄａｒｄｓ． ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｂｒｏｔｈ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ ｙｅａｓｔｓ； Ａｐｐｒｏｖｅｄ ｓｔａｎｄａｒｄ． Ｍ２７－Ａ ［Ｓ］． Ｗａｙｎｅ． ２００２．

［１４］ 姚新生．天然藥物化學(xué)［Ｍ］．北京：人民衛(wèi)生出版社， ２００１．

［１５］ 梁曉英，郭娜，王麗莎，等．白鮮堿體外抗白色念珠菌活性研究［Ｊ］. 中國農(nóng)學(xué)通報，２００９，２５（１６）：２１－２４

［１６］ 苗抗立，張建中，董穎，等．苦參的化學(xué)成分及藥理的研究進展［Ｊ］． 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，２００１，１３（２）：６９－７３．

［１７］ 田君，池汝安，高洪． 乙醇提取土茯苓黃酮甙的動力學(xué)研究［Ｊ］． 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，２００５，１７（１）：１１－１５．

［１８］ 王麥玲，張繼文，錢勇．白鮮皮殺菌活性成分的研究［Ｊ］．農(nóng)藥，２００６，４５ （１１）：７３９－７４１．

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文