HPLC法測定廣藿香中齊墩果酸和熊果酸的含量

摘要：采用超聲技術提取廣藿香中齊墩果酸和熊果酸，以薄層層析色譜法對齊墩果酸和熊果酸進行定性分析，以高效液相色譜法進行定量分析，液相條件為：色譜柱為Ｃ１８柱（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ μｍ），流動相為乙腈－甲醇－０．３％Ｈ３ＰＯ４水溶液（６０∶３０∶１０，Ｖ／Ｖ），流速０．８ ｍＬ／ｍｉｎ，檢測波長２１０ ｎｍ，柱溫２８℃。結果表明，齊墩果酸和熊果酸的濃度與峰面積呈良好的線性關系，其線性范圍分別為０．０２０ ５～０．４１０ ４ μｇ（Ｒ＝０．９９９ ４）和０．０２０ ７～０．４１４ ４ μｇ（Ｒ＝０．９９９ ０）， 樣品中兩者的平均回收率分別為９７．５３％和９８．５５％，ＲＳＤ分別為１．４％和１．６％，測得樣品中齊墩果酸和熊果酸的含量分別為０．１０３ ｍｇ／ｇ和０．１６９ ｍｇ／ｇ。

關鍵詞：廣藿香；齊墩果酸；熊果酸；薄層色譜法；高效液相色譜法

中圖分類號：Ｒ２８４．２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）10－2111-03

Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｌｅａｎｏｌｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｕｒｓｏｌｉｃ Ａｃｉｄ ｉｎ Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ ｃａｂｌｉｎ ｂｙ ＨＰＬＣ

ＳＵＮ Ｒｅｎ－ｓｈｕａｎｇ１，ＭＥＮＧ Ｊｕｎ２

（１． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｔｏｎｇｈｕａ Ｎｏｒｍａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｔｏｎｇｈｕａ １３４００２， Ｊｉｌｉｎ， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｔｏｎｇｈｕａ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｊｉｌｉｎ， Ｔｏｎｇｈｕａ １３４０００， Ｊｉｌｉｎ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｕｒｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｏｌｅａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｆｒｏｍ Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ ｃａｂｌｉｎ（Ｂｌａｎｃｏ）Ｂｅｎｔｈ． ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ by ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｅｄ ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｌｙ ｂｙ ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＴＬＣ）． Ｔｈｅ ｔｗｏ ａｃｉｄs ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｃ１８ ｃｏｌｕｍｎ （２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ， ５ μｍ） ｗｉｔｈ ａ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ｏｆ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ－ｍｅｔｈａｎｏｌ－０．３％ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｃｉｄ （６０∶３０∶１０，Ｖ／Ｖ） ａｔ ０．８ ｍＬ／ｍｉｎ and ２８℃， ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｔ ２１０ ｎｍ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ ｏｌｅａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｕｒｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｗｅｒｅ ｌｉｎｅａｒ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ０．０２０ ５～０．４１０ ４ μｇ （Ｒ＝０．９９９ ４） ａｎｄ ０．０２０ ７～０．４１４ ４ μｇ（Ｒ＝０．９９９ ０） ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ recoveries ｏｆ ｏｌｅａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｕｒｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｗｅｒｅ ９７．５３％ ｗｉｔｈ ＲＳＤ ｏｆ １．４％ ａｎｄ ９８．５５％ ｗｉｔｈ ＲＳＤ ｏｆ １．６％； ０．１０３ ｍｇ／ｇ ｏｆ ｏｌｅａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ０．１６９ ｍｇ／ｇ ｏｆ ｕｒｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ in the sample．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ ｃａｂｌｉｎ （Ｂｌａｎｃｏ）Ｂｅｎｔｈ．； ｏｌｅａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ； ｕｒｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ； ＴＬＣ； ＨＰＬＣ

廣藿香為唇形科植物廣藿香Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ ｃａｂｌｉｎ （Ｂｌａｎｃｏ）Ｂｅｎｔｈ．的干燥地上部分［１］。目前普遍認為廣藿香主要有效成分存在于其揮發油中，但也有研究表明，廣藿香全草中的山楂酸、齊墩果酸和熊果酸等三萜類化合物同樣具有生理活性［２，３］。熊果酸與齊墩果酸為同分異構體，是植物的次生代謝產物，其中熊果酸具有顯著降低谷丙轉氨酶、增進食欲和恢復肝功能的作用；而齊墩果酸可消黃疸、對急慢性肝炎具有一定功效。目前，已有對熊果酸與齊墩果酸進行定量分析的報道［4］。該項研究采用薄層層析色譜（Ｔｈｉｎ Ｌａｙｅｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＴＬＣ）進行了定性分析，并用高效液相色譜法（Ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＰＬＣ）同時測定了廣藿香中熊果酸和齊墩果酸的含量。這將為廣藿香的質量控制及綜合開發利用提供試驗依據。

１材料與方法

１．１試劑與材料

齊墩果酸和熊果酸（供含量測定用，批號分別為１１０７０９－２００３０４、１１０７４２－２００５１６，中國藥品生物制品檢定所）；乙腈為色譜純，實驗用水為超純水，碘為化學純，其余試劑為分析純，硅膠Ｇ薄層預制板（１０ ｃｍ×２０ ｃｍ）購至青島海洋化工廠。

廣藿香采自高要市蓮塘鎮，經通化師范學院于俊林教授鑒定為唇形科刺蕊草屬植物廣藿香Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ ｃａｂｌｉｎ（Ｂｌａｎｃｏ）Ｂｅｎｔｈ．。儀器主要有高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），ＫＱ－２０００ＫＤＢ型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

１．2薄層分析法分析廣藿香

１．2．１標準溶液的制備精密稱取標準品齊墩果酸５．１３０ ｍｇ和熊果酸５．１８０ ｍｇ，分別用甲醇定容至25 ｍL，配成齊墩果酸和熊果酸標準溶液，齊墩果酸的濃度為０．２０５ ２ ｍｇ／ｍＬ，熊果酸的濃度為０．２０７ ２ ｍｇ／ｍＬ。

１．2．２供試品溶液的制備精密稱取廣藿香藥材粉末１.00 ｇ，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇２０ ｍＬ，超聲處理６０ ｍｉｎ，過濾，收集濾液，剩余殘渣重復用１０ ｍＬ甲醇洗滌2次，收集洗滌液后，定容至50 ｍＬ，待用。

１．2．３薄層預處理和分離分別吸取齊墩果酸、熊果酸標準品溶液和供試品溶液，點樣于同一硅膠Ｇ薄層板上。將薄層板點樣的一端浸入１％（m/V）碘－二氯甲烷溶液中約１２～１５ ｍｍ，使溶液沒過斑點后迅速取出，立即覆以一玻璃板，３０ ｍｉｎ后取下玻璃板，熱風吹２～３ ｍｉｎ。再以環己烷－二氯甲烷－乙酸乙酯－冰醋酸（２０∶５∶８∶０．１，Ｖ／Ｖ）為展開劑，展開，取出，晾干，噴１０％（Ｖ／Ｖ）硫酸乙醇溶液，于１０５℃加熱至斑點顯色清晰［４］。

１．3廣藿香中齊墩果酸和熊果酸的含量測定

１．3．１標準溶液與供試品溶液的制備精密吸取經ＴＬＣ鑒別后的齊墩果酸和熊果酸標準溶液各１ ｍＬ，加入１０％（Ｖ／Ｖ）甲醇定容至１０ ｍＬ，制成含２０．５ μｇ/ｍＬ的齊墩果酸和２０．７ μｇ/ｍＬ的熊果酸混合標準溶液。供試品溶液的制備同１．2．２。

１．3．２色譜條件Ｃ１８柱（４．６ ｍｍ×２５０ ｍｍ，５ μｍ）；流動相：乙腈－甲醇－０．３％Ｈ３ＰＯ４水溶液（６０∶３０∶１０，Ｖ／Ｖ）；流速為０．８ ｍＬ／ｍｉｎ；檢測波長２１０ ｎｍ；柱溫為室溫；外標法定量分析［５］。熊果酸和齊墩果酸峰分離度為１．５４，理論塔板數分別為１６ ４６９和１６ ９２１。

２結果與分析

２．１ＴＬＣ結果分析

ＴＬＣ結果見圖１，樣品與齊墩果酸和熊果酸標準品在相同位置上顯相同的紫色斑點，可知廣藿香樣品中含有齊墩果酸和熊果酸。

２．２廣藿香中齊墩果酸和熊果酸含量的測定

２．２．１線性關系的考察精密吸取齊墩果酸和熊果酸混合標準品１、５、１０、１５和２０ μＬ分別進樣，按上述色譜條件平行測定３次，以標準進樣量為橫坐標，以峰面積積分值為縱坐標，進行線性回歸，得齊墩果酸回歸方程為＝６９０．４１－２．３０５ ９，Ｒ＝０．９９９ ４；熊果酸回歸方程為＝５６２．４２＋４．５３５ ５，Ｒ＝０．９９９ ０，表明當齊墩果酸進樣量在０．０２０ ５～０．４１０ ４ μｇ之間，熊果酸進樣量在０．０２０ ７～０．４１４ ４ μｇ之間時，呈良好線性關系［６］。

２．２．２精密度試驗精密吸取熊果酸和齊墩果酸的混合標準液１０ μＬ，平行進樣５次，在２．２．１條件下，測得熊果酸峰面積的相對標準偏差（ＲＳＤ）為０．９％（ｎ＝５），齊墩果酸峰面積ＲＳＤ為０．６％（ｎ＝５），說明儀器精密度符合要求。

２．２．３穩定性試驗精密吸取同一份供試品溶液，分別于０ ｈ、２ ｈ、４ ｈ、８ ｈ和１２ ｈ后進樣１０ μＬ分析，測得峰面積ＲＳＤ值分別為１．５％和１．８％，說明在１２ ｈ內樣品穩定性較好。

２．２．４回收率試驗取已知含量廣藿香藥材粉末約０．３０ ｇ，精密稱取５份，每份加入標準液１ ｍＬ，測定峰面積，計算回收率，結果樣品中齊墩果酸和熊果酸的平均回收率分別為９７．５３％和９８．５５％，ＲＳＤ分別為１．４％和１．６％。

２．２．５樣品測定按上述色譜條件對熊果酸和齊墩果酸的標準混合溶液及廣藿香供試品液進行分析［７］，結果見圖２，結果表明廣藿香中齊墩果酸的含量為０．１０３ ｍｇ／ｇ，熊果酸的含量為０．１６９ ｍｇ／ｇ。

３討論及結論

３．１提取條件的選擇

在預試驗中，我們以齊墩果酸和熊果酸的含量作為考察指標，篩選并確定最佳提取方法。結果表明，提取劑和提取時間對試驗結果影響不大，采用甲醇超聲６０ ｍｉｎ提取樣品的結果較好［８］。

３．２流動相的選擇

齊墩果酸和熊果酸均為五環三萜類同分異構體，在中性流動相中三萜酸可解離，導致該化合物很難分離。驗中曾采用甲醇－水不同比例的流動相［９，１０］，分離效果均不理想。流動相中增加適量磷酸可改善峰形，有利于２種三萜酸分離，在反相柱上甲醇的比例增減對兩者的分離影響較大，經過反復試驗，最終選擇乙腈－甲醇－０．３％Ｈ３ＰＯ４水溶液（６０∶３０∶１０，Ｖ／Ｖ）作為流動相，且流動相預先混合的基線較為平穩，能使二者得到良好分離。

試驗結果表明，廣藿香中含有生理活性物質齊墩果酸和熊果酸，對廣藿香中的齊墩果酸和熊果酸進行分離提取和含量測定，可為進一步開發和利用廣藿香提供理論依據。

參考文獻：

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［４］ 嚴華，張聿梅，林瑞超． 原位預處理－薄層掃描法同時測定女貞子中齊墩果酸與熊果酸的含量［Ｊ］． 藥物分析雜志，２００９，２９（７）：１１０７－１１１０．

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