大麗輪枝菌拮抗細(xì)菌多粘芽孢桿菌7-4菌株的篩選與鑒定

摘要：為篩選對(duì)棉花黃萎病病原菌大麗輪枝菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ）具有拮抗作用的芽孢細(xì)菌，采用改良的瓊脂平板擴(kuò)散法，通過初篩從各地的土樣中分離到８４株拮抗細(xì)菌菌株，再對(duì)其進(jìn)行復(fù)篩，得到１株具有較強(qiáng)抑菌活性的拮抗細(xì)菌７－４菌株，并對(duì)該菌株進(jìn)行了形態(tài)特征觀察和生理生化鑒定，初步判斷其為多粘芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）。

關(guān)鍵詞：大麗輪枝菌；拮抗細(xì)菌；篩選；鑒定；多粘芽孢桿菌

中圖分類號(hào)：Ｓ４７６ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ 文章編號(hào)：0439－８114（２０11）09－1797-03

Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｓｔｒａｉｎ ７－４ ａｇａｉｎｓｔ

Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ

ＷＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｙｉｎｇａ，ＭＥＮＧ Ｃｈｅｎｇ－ｓｈｅｎｇａ，ＬＥＩ Ｂａｉ－ｓｈｉｂ

（ａ． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ；ｂ．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｂｅｉ， Ｂａｏｄｉｎｇ ０７１００１， Ｈｅｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｇａｉｎｓｔ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ， ８４ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｏｉｌ in ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ areas ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｅｄ by ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｇａｒ ｐｌａｔｅ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ｏｆ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ｖｉａ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ． Ａｓ ａ ｒｅｓｕｌｔ， ａ ｓｔｒａｉｎ ｃａｌｌｅｄ ７－４ ｗｈｉｃｈ ｈａｄ ｓｔｒｏｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ． According to ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ characters， ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，the strain 7-4 ｗａｓ preliminarily ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ； ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ； ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ； ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ； Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ

棉花黃萎病是由大麗輪枝菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ Ｋｌｅｂ．）引起的一種真菌性病害，此病原菌首先于１９１４年在美國(guó)的弗吉尼亞州被發(fā)現(xiàn)，隨后蔓延到世界上其他的產(chǎn)棉國(guó)，１９３５年傳入中國(guó)［１］。目前，棉花黃萎病已經(jīng)蔓延到全國(guó)各產(chǎn)棉區(qū)，并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，防治難度較大，至今尚無特效的防治藥劑，已成為棉花生產(chǎn)的主要障礙之一。現(xiàn)階段只能依靠以種植抗病品種為主的綜合防治措施，但由于高抗黃萎病的棉花品種少，且對(duì)大麗輪枝菌致病的機(jī)理以及棉花抗黃萎病的遺傳方式了解還比較少。因此，在目前缺乏有效抗源的情況下，生物防治將是一種重要的輔助防治手段［２］。而獲得高效拮抗菌是生物防治的基礎(chǔ)。產(chǎn)芽孢菌是自然界廣泛存在的一類細(xì)菌，其中一部分可以產(chǎn)生抗菌肽、大環(huán)脂、環(huán)脂等十幾種抗菌物質(zhì)，從而起到抑制或防治作物病害的作用［３－６］。

本試驗(yàn)從不同來源的土樣中篩選大麗輪枝菌的拮抗芽孢細(xì)菌，以期獲得具有較好生物防治潛力的拮抗菌株并對(duì)其進(jìn)行生理生化鑒定。

１材料和方法

１．１供試病原菌

大麗輪枝菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ Ｋｌｅｂ．）Ｖ－１９０菌株，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物制藥實(shí)驗(yàn)室保存。

１．２培養(yǎng)基

ＮＡ培養(yǎng)基、ＮＢ培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基（ＰＤＡ）成分及制備參見文獻(xiàn)［７］，生理生化鑒定培養(yǎng)基制備及試劑參照文獻(xiàn)［８］。

１．３試驗(yàn)方法

１．３．１土樣采集從邢臺(tái)、保定、唐山、邯鄲、滄州等地的棉田中取１０～１５ ｃｍ深處土樣，風(fēng)干后，保存于牛皮紙袋中。記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)等信息。

１．３．２土壤中芽孢細(xì)菌的分離純化取土樣１．０ ｇ研細(xì)，加入裝有９．０ ｍＬ無菌水的試管中搖勻，８０ ℃水浴３０ ｍｉｎ，然后取１．０ ｍＬ進(jìn)行１０倍梯度稀釋至１０－６，分別取１０－４、１０－５、１０－６ ３個(gè)梯度的稀釋液０．１ ｍＬ涂布在ＮＡ培養(yǎng)基平板上，３７ ℃倒置培養(yǎng)２４ ｈ。挑取形態(tài)、大小、色澤不同的單菌落分別轉(zhuǎn)接至ＮＡ斜面上，并分別進(jìn)行菌株編號(hào)，３７ ℃培養(yǎng)２４ ｈ，置于４ ℃冰箱保存?zhèn)溆茫郏梗荨Ｍ瑫r(shí)采用平板劃線法檢測(cè)每株菌的純度。

１．３．３大麗輪枝菌混菌平板的制備向培養(yǎng)１０ ｄ左右的大麗輪枝菌斜面加５．０ ｍＬ無菌水，用接種環(huán)輕輕刮取斜面上的孢子，搖勻，形成孢子懸液。再將孢子懸液加入融化后冷卻到５０ ℃左右的ＰＤＡ培養(yǎng)基中，迅速搖勻，倒平板，凝固待用。

１．３．４大麗輪枝菌拮抗細(xì)菌的初篩取制備好的大麗輪枝菌混菌平板，用接種環(huán)從分離到的細(xì)菌斜面上挑取少許菌體點(diǎn)種在ＰＤＡ平板上，２４℃培養(yǎng)３ ｄ，挑選出有抑菌圈的拮抗菌株備用。

１．３．５大麗輪枝菌拮抗細(xì)菌的復(fù)篩將初篩獲得的拮抗細(xì)菌活化后接種于裝有５０ ｍＬ ＮＢ培養(yǎng)基的２５０ ｍＬ三角瓶中，于３０ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ搖床上振蕩培養(yǎng)４８ ｈ。

在制備大麗輪枝菌混菌平板時(shí)，向培養(yǎng)基中加入終濃度為０．２５ μｇ／ｍＬ鏈霉素，放冷后，用打孔器打出一定數(shù)量均勻的孔，分別向每孔中加入７０ μＬ培養(yǎng)４８ ｈ的拮抗細(xì)菌發(fā)酵液上清，靜置３０ ｍｉｎ，２４ ℃培養(yǎng)３ ｄ。測(cè)量抑菌圈直徑，挑選出抑菌圈大且清晰的菌株［１０］作為目的菌株，用于后續(xù)試驗(yàn)。

１．３．６菌株的形態(tài)特征觀察采用稀釋涂平板法將適當(dāng)濃度的目的菌株菌懸液涂布在ＮＡ平板上，靜置３０ ｍｉｎ，３７ ℃倒置培養(yǎng)２４ ｈ，觀察菌落形態(tài)特征。

從３７ ℃培養(yǎng)２４ ｈ的斜面上挑取少量目的菌株的菌體進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色，染色方法參見文獻(xiàn)［８］，顯微鏡下觀察其菌體和芽孢形態(tài)。

１．３．７菌株的生理生化鑒定根據(jù)《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［８］及《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［１１］中相應(yīng)屬、種鑒定有關(guān)的內(nèi)容，選取了以下生理生化試驗(yàn)對(duì)目的菌株進(jìn)行鑒定：Ｖ．Ｐ試驗(yàn)、酪素水解試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、耐鹽試驗(yàn)、酪氨酸水解試驗(yàn)。

２結(jié)果與分析

２．１拮抗細(xì)菌的初篩結(jié)果

從土樣中共分離得到４００余個(gè)菌株，經(jīng)初篩獲得８４株拮抗菌株，其中有１８株產(chǎn)生的抑菌圈直徑較大、抑菌能力較好（表１）。

２．２拮抗細(xì)菌的復(fù)篩結(jié)果

將初篩獲得的拮抗能力較好的１８株菌株進(jìn)行復(fù)篩，其中４株拮抗菌株（４－５９、７－４、８－５４、１２－２３）的發(fā)酵液上清液表現(xiàn)拮抗活性。對(duì)復(fù)篩得到的４株拮抗細(xì)菌所分泌的拮抗物質(zhì)進(jìn)行抗菌活性的比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)７－４菌株的無菌拮抗物質(zhì)溶液對(duì)大麗輪枝菌表現(xiàn)的拮抗活性最高（表２，圖１）。

２．３７－４菌株的菌落特征

７－４拮抗菌株在ＮＡ平板上單菌落呈圓形，邊緣整齊，不透明，乳白色，表面微有皺褶，不光滑，呈饅頭狀（圖２）。

２．４７－４菌株的菌體特征

７－４菌株細(xì)胞經(jīng)染色后在顯微鏡下觀察呈桿狀，革蘭氏染色呈陽性，菌體大小為０．７～０．８ μｍ×２．０～３．０ μｍ；可形成內(nèi)生芽孢，芽孢囊明顯膨脹，芽孢橢圓形、中生到次端生、稍膨大（圖３）。

２．５７－４菌株的生理生化鑒定結(jié)果

７－４菌株的生理生化鑒定結(jié)果見表３。結(jié)合７－４菌株的形態(tài)特征和生理生化特征綜合考察，根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［１１］初步判斷其為多粘芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）。

３討論

試驗(yàn)中某些初篩活性很高的菌株進(jìn)入復(fù)篩后，其抑菌活性明顯降低，甚至消失，這可能是由于抑菌機(jī)制不同（比如營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)與分泌抗菌素），或者是培養(yǎng)條件不合適所導(dǎo)致的，如果換用其他培養(yǎng)基或優(yōu)化培養(yǎng)基配方，應(yīng)該還可以獲得抑菌效果不錯(cuò)的菌株。事實(shí)也證明當(dāng)適當(dāng)改變培養(yǎng)基配方時(shí)，以前抑菌活性較弱的菌株其抑菌活性有明顯提高，這也表明發(fā)酵條件對(duì)拮抗物質(zhì)的產(chǎn)生具有重要影響。

本試驗(yàn)復(fù)篩是采用搖瓶發(fā)酵，再用其發(fā)酵液上清進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，因此本試驗(yàn)復(fù)篩獲得的４株拮抗細(xì)菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)可以認(rèn)為是胞外產(chǎn)物，而且產(chǎn)生的抑菌圈在室溫放置一個(gè)月后，抑菌圈中仍無病原菌長(zhǎng)出，說明其性質(zhì)比較穩(wěn)定。其后對(duì)其進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)這些抑菌物質(zhì)均為蛋白（或多肽），因此在后續(xù)的研究中，可以進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化、拮抗多肽的分離純化、蛋白多肽的基因克隆等。

生物防治作為棉花黃萎病最有前景的防治方法之一，在防治棉花黃萎病，最大限度地降低該病害造成的損失，提高棉花生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益方面具有重大意義。芽孢桿菌作為植物病害生防細(xì)菌之一，由于其抗逆性強(qiáng)，抗菌譜廣泛，對(duì)多種病原真菌、細(xì)菌均有較強(qiáng)的抑制作用，而引起研究者的廣泛關(guān)注。目前，生防研究所涉及的芽孢桿菌種類主要有枯草芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、多粘芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）、蠟狀芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、地衣芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）等［１２－１５］。因此，本試驗(yàn)主要是針對(duì)產(chǎn)芽孢細(xì)菌進(jìn)行篩選，這樣便于菌劑商品的保存，也可以使試驗(yàn)成果更便捷地在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用。

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