激光掃描共聚焦顯微鏡顯示土壤原生動物細胞結構的研究

摘要：介紹了一種運用激光掃描共聚焦顯微術顯示土壤原生動物細胞結構的方法，試驗結果較清晰地顯示出該纖毛蟲細胞表面纖毛器及纖毛器基部附屬微管結構，并總結了試驗操作過程中的注意點。

關鍵詞：激光掃描共聚焦顯微術；土壤原生動物；細胞結構

中圖分類號：Ｑ－３３６ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）09－1888-02

Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｔｏ Ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ

Ｓｏｉｌ Pｒｏｔｏｚｏａ

ＹＵＮ Ｍｉ－ｘｉａ，ＧＵＯ Ｊｉａｎ，ＮＩ Ｂｉｎｇ，ＳＨＥＮＧ Ｘｉｎ，ＣＨＥＮ Ｊｉ－ｗｕ，ＧＵ Ｆｕ－ｋａｎｇ

（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｅａｓｔ Ｃｈｉｎａ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００６２，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ cell ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｓｏｉｌ ｐｒｏｔｏｚｏａ ｗａｓ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ． Ａｎｄ ａｌｓｏ， ｔｈｅ ｋｅｙｓ ｉｎ ａｃｔｕａｌ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｓｕｍｍａｒｉｅｄ． Ｔｈｅ ｃｉｌｉａｔｕｒｅ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌａｒ ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｂａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ ｉｎ ｔｈｅ cell surface ｏｆ ｓｏｉｌ ｐｒｏｔｏｚｏａ ｗｅｒｅ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ ｓｈａｒｐｌｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ； ｓｏｉｌ ｐｒｏｔｏｚｏａ； cell ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ

在農林土壤生態系統中，土壤原生動物是土壤動物區系不同水平生物之間形成食物鏈結構的一個環節，其不僅加強了土壤營養物質再循環的效應，而且還在促進植物根系對營養物質的吸收和加強植物生長方面起著重要的作用［１］。目前對土壤原生動物的研究在宏觀生態學方面取得了較多的成果，但對土壤原生動物形態的觀察則仍主要應用光學顯微鏡，尚未深入到其胞器結構水平。

激光掃描共聚焦顯微鏡在熒光顯微鏡成像基礎上加裝了激光掃描裝置，利用計算機進行圖像處理，用紫外或可見光激發熒光探針，從而顯示細胞或組織內部微細結構的熒光圖像［２］。利用它對樣品的連續斷層掃描和三維重建圖像技術，將獲得的一系列連續掃描圖像進行合成，不但可以獲得清晰的細胞結構和細胞的長、寬、厚、斷層面積、細胞體積等參數，并且能隨意觀察細胞各個側面的三維立體結構［２］。目前激光掃描共聚焦顯微鏡三維重建組織細胞結構的方法已普遍運用到細胞結構的研究中［３，４］，但運用該技術來顯示土壤原生動物胞器結構的研究鮮見報道。近年來作者所在實驗室摸索出一種運用激光掃描共聚焦顯微鏡三維圖像重建技術與熒光紫杉醇（ＦＬＵＴＡＸ）直接熒光技術相結合，顯示出土壤纖毛蟲胞器的三維立體結構的方法，取得了較理想的效果，現將此方法介紹如下。

１材料與方法

１．１試驗材料

細胞材料：取采自浙江溫州青龍湖地區的一種土壤纖毛蟲，用麥粒發酵液獲得的細菌作為餌料，建立純系培養。待纖毛蟲培養至較高密度后，取生長狀態良好的細胞作為試驗材料。

試劑制備：①ＰＨＥＭ緩沖液（６０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＩＰＥＳ，２５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ，１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＧＴＡ，６ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣＩ２·６Ｈ２Ｏ，ｐＨ值６．９）；②０．５％皂苷溶液（０．５ ｇ皂苷，ＰＨＥＭ緩沖液定容至１００ ｍＬ）；③４％多聚甲醛固定液（４ ｇ多聚甲醛，ＰＨＥＭ緩沖液定容至１００ ｍＬ）；④０．５％的Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００滲透液（０．０５ ｍＬ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００，ＰＨＥＭ緩沖液定容至1０ ｍＬ）；⑤ＰＢＳ磷酸鹽緩沖液（１３６．８ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，２．７ ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣＩ，１０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４，１．８ ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ值７．４）；⑥ＦＬＵＴＡＸ－２：７－Ｏ［Ｎ－（４’－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｃａｒｂｏｎｙｌ）－Ｌ－ａｌａｎｙｌ］Ｔａｘｏｌ（購于Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公司），規格為５０ ｍｇ，先用二甲亞砜（ＤＭＳＯ）配制成１ ｍｍｏｌ／Ｌ的母液，分裝后置于－２０℃保存，使用時用ＰＢＳ將其稀釋至１ μｍｏｌ／Ｌ。

１．２試驗方法

熒光紫杉醇直接熒光標記制備激光掃描共聚焦標本采用ＦＬＵＴＡＸ法［５－７］，其主要步驟為：①在載玻片上滴１００ μＬ濃度為０．５％的皂苷，將高濃度的細胞滴入皂苷中滲透１０ ｓ，用ＰＨＥＭ清洗１次；②４％多聚甲醛中固定５ ｍｉｎ，ＰＨＥＭ清洗１次；③０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００處理１０ ｓ，ＰＨＥＭ清洗１次；④１ μｍｏｌ／Ｌ ＦＬＵＴＡＸ－２染色５ ｍｉｎ，０．０１ ｍｏｌ／Ｌ的ＰＢＳ漂洗６次。

激光掃描共聚焦顯微鏡（ＬＥＩＣＡ ＴＣＳ ＳＰ５）操作：①打開計算機、顯微鏡及熒光電源；②選用染料ＦＩＴＣ的波長及激光管，觀察標本，找到觀察對象；③光路轉換至掃描觀察模式，設置掃描分辨率、目鏡倍數和掃描放大倍數等，快速預覽，調整激光管電壓、光電倍增功率等至最佳狀態；④拍照采集共聚焦圖像，進行三維重建，獲取圖像并保存。

２結果與分析

激光掃描共聚焦顯微鏡術顯示，這種土壤纖毛蟲細胞表面纖毛器由口圍帶、波動膜、額腹橫棘毛、左右緣棘毛等纖毛器微管組成，其細胞表膜下含口圍帶基部小膜托架及與托架相聯系的微管，額腹橫棘毛基部前縱微管束、后縱微管束、橫微管束等纖毛器基部附屬微管（圖１）。分析其細胞的運動胞器及其細胞骨架，可揭示該纖毛蟲在土壤結構中的運動、取食及與土壤環境的作用關系。

３小結與討論

激光掃描共聚焦顯微鏡所顯示的細胞結構三維圖像分辨率高，背景干擾少，圖像清晰度高而且還可以使細胞旋轉，隨意觀察各個側面的結構。一張理想的激光掃描共聚焦照片，需要做到其所顯示的圖像反差適中、細胞飽滿而不變形、細胞結構清晰。根據作者的實踐，成功的關鍵主要涉及原生動物細胞的狀態、選擇合適的載玻片、防止樣品干燥和對樣品的沖洗及標本的照相等方面，例如，應該選擇生長狀態良好的原生動物作為材料，這樣得到的樣品一般是內部結構比較均一且細胞形態比較完整；選擇０．１３～０．１７ ｍｍ厚的蓋玻片作為制備樣品的載玻片，無需使用蓋玻片，可以保證在掃描過程中得到整個細胞各個不同面的切片，保持細胞原有的形態；由于不蓋片，樣品容易干燥，防止樣品干燥是很關鍵的一步，因此載玻片上要留有足量的緩沖液，同時在觀察樣品的過程中應每隔１０ ｍｉｎ向載玻片上滴加一次緩沖液；另外在染色過程中要避光，ＦＬＵＴＡＸ染色前后用ＰＢＳ清洗多次，以洗去未結合的ＦＬＵＴＡＸ以及染上ＦＬＵＴＡＸ的雜質，提高對比度，減少背景色干擾；最后激光掃描共聚焦顯微鏡拍照時，快速找到觀察對象，光路轉換至掃描觀察模式，調至最佳狀態，對樣品進行左右、上下不同層次掃描，拍照采集不同層面的圖像，進行三維重建。

該方法也適用于其他土壤微生物標本的制備和觀察，對不同水體的微生物細胞結構的研究也具有參考價值。

參考文獻：

［１］ 顧福康．原生動物學概論［Ｍ］． 北京：高等教育出版社，１９９１．

［２］ 李楠，王黎明，楊軍．激光共聚焦顯微鏡的原理和應用［Ｊ］． 軍醫進修學院學報， １９９６，１７（３）：２３２－２３４．

［３］ 肖艷梅，付道林，李安生．激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）及其生物學應用［Ｊ］．激光生物學報，１９９９，８（４）：３０５－３１１．

［４］ 林鈺龍，陳耀文， 劉鴻禧，等．激光掃描共聚焦顯微鏡對人類染色體三維結構的觀察［Ｊ］． 激光生物學報，２００２，１１（１）：３４－３６．

［５］ ＡＲＲＥＧＵＩ Ｌ， ＭＵＮＯＺ－ＦＯＮＴＥＬＡ Ｃ， ＳＥＲＲＡＮＯ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｄｉｒｅｃｔ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌａｒ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ ｏｆ ｃｉｌｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｏｚｏａ ｗｉｔｈ ａ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｔａｘｏｉｄ［Ｊ］． Ｊ Ｅｕｋａｒｙｏｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２００２，４９（4）：３１２－３１８．

［６］ ＡＲＲＥＧＵＩ Ｌ，ＭＵＮＯＺ－ＦＯＮＴＥＬＡ Ｃ，ＧＵＩＮＥＡ Ａ，ｅｔ ａｌ． ＦＬＵＴＡＸ ｆａｃｉｌｉtａｔｅｓ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｉｌｉａｔｕｒｅ ｏｆ oｘｙｔｒｉcｈｉｄ ｈｙｐｏｔｒｉｃｈｓ［Ｊ］． Ｅｕｒｏｐ Ｊ Ｐｒｏｔｉｓｔｏｌ，２００３，３９（2）：１６９－ｌ７２．

［７］ 何蘭，曾紅， 沈潔，等． ＦＬＵＴＡＸ 法顯示纖毛蟲微管胞器的改良［Ｊ］． 動物學雜志，２００６，４１（３）：５９－６１．