“湘益”牌茯磚茶真菌的分離及鑒定研究

摘要：采用平板梯度稀釋法對金湘益特制禮品茯磚茶中真菌進行了分離純化和計數，獲得２３０１、２４０１、３３０２、４３０４、５４０２等５種類型真菌，其中５４０２為優勢菌，每克茶樣中含量達４．９8×１０６個，其余為非優勢菌，數目相對較少。運用１８Ｓ ｒＤＮＡ片段序列進行同源比對，結合形態學鑒定方法對其進行鑒定，表明菌株２３０１為產紫青霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、２４０１為產黃青霉（Ｐ. ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、３３０２ 為青霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）、４３０４ 為醬油曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、５４０２ 為蠟葉散囊菌（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ｈｅｒｂａｒｉｏｒｕｍ）。

關鍵詞：“湘益”牌茯磚茶；真菌分離；１８Ｓ ｒＤＮＡ同源比對；形態學特征；菌種鑒定

中圖分類號：ＴＳ２７２．５＋４；Ｑ９４９．３２文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）09－1765-05

A Preliminary Research on Separation and Identification of the Fungi form

XIANG-YI Fuzhuan Tea

ＬＩＵ Ｓｈｉ－ｑｕａｎ１，２，ＺＨＡＯ Ｙｕｎ－ｌｉｎ１，２，ＬＥＩ Ｃｕｎ－ｘｉ１，ＤＯＮＧ Ｍｅｎｇ１，ＰＥＮＧ Ｘｉａｏ－ｙｕｎ１，ＺＨＯＵ Ｘｉａｏ－ｍｅｉ１

（１． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｈｕｎａｎ Ｃｉｔｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙｉｙａｎｇ ４１３０００， Ｈｕｎａｎ， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈｕｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０１２８， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｆｕｎｇｉ on ＸＩＡＮＧ－ＹＩ Ｆｕｚｈｕａｎ ｔｅａ ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ， ａｎｄ ｔｈｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ １８Ｓ ｒＤＮＡ． Ｆｉｖｅ ｓｔｒａｉｎｓ，２３０１， ２４０１， ３３０２， ４３０４ ａｎｄ ５４０２， ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ． Among those ５４０２ ｗａｓ ｔｈｅ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ， as its density ｒｅａｃｈｅｄ ４．９8×１０６ ind/g ｏｆ ｄｒｉｅｄ ｔｅａ． ２３０１， ２４０１， ３３０２， ４３０４ ａｎｄ ５４０２ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ， Ｐ. ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ， Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．， Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ ａｎｄ Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ｈｅｒｂａｒｉｏｒｕｍ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ＸＩＡＮＧ－ＹＩ Ｆｕｚｈｕａｎ ｔｅａ； ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｇｉ； ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ １８Ｓ ｒＤＮＡ； ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ； ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｇｉ

茯磚茶，是古老茶類黑茶中的高檔品種，據《明史·茶法》記載，早在明嘉靖三年即公元１５２４年前，茯磚茶就被規定為運往西北供少數民族所需的官茶。茯磚茶與綠茶、紅茶比較，綠茶屬非發酵茶，紅茶屬半發酵茶，而茯磚茶屬于完全發酵茶，其加工工藝獨特，獨具菌花香［１，２］。傳統的特制茯磚茶已有５００年的生產歷史；茯磚茶呈金黃色顆粒（俗稱“金花”），經中外科學家分析鑒定，具有極強地分解油膩、消食、調節人體脂肪代謝的功能，特別適應于飲食結構中以奶肉類為主的人們飲用［３］。

湖南省益陽茶廠有限公司生產的“湘益”牌系列產品質量穩定可靠、品質優良，在國內同行業中處于領先地位。“湘益”牌系列茯磚茶是具有濃郁地方特色的黑茶種類之一，是選用優質茶葉為原料，經科學配方、精制加工而成。其外形整齊如磚片，內質金花普茂，菌香濃郁，開湯后湯色紅濃、滋味醇厚、香氣純正，具有消食健胃的顯著效果，深受新疆、青海、甘肅、西藏等省、自治區廣大消費者的喜愛。為促進“湘益”牌系列茯磚茶發酵關鍵技術的突破，本研究選用金湘益（“湘益”牌系列產品之一）特制禮品茯磚茶就其微生物種類進行鑒定研究，以期為益陽黑茶發酵關鍵技術控制奠定堅實的基礎。

１材料與方法

１．１材料與儀器

２００７年產金湘益特制禮品茯磚茶，采用平板梯度稀釋法分離獲得的真菌。

培養基：改良ＰＤＡ培養基（加１％茶汁）、查氏培養基、麥芽汁培養基、查氏酵母膏培養基、２０％蔗糖查氏培養基、４０％蔗糖麥芽汁培養基。

主要儀器：微型植物粉碎機、超凈工作臺、電熱恒溫培養箱、冰箱、數碼顯微鏡、電子天平、高壓滅菌鍋等。

１．２方法

１．２．１真菌分離與計數用電子天平準確稱取１．０００ ０ ｇ金湘益特制禮品茯磚茶１００目過篩粉碎樣品，定容至１０ ｍＬ，配成１０－１、１０－２、１０－３、１０－４、１０－５各１０ ｍＬ，取１０－３、１０－４、１０－５等３個梯度各０．５ ｍＬ用改良ＰＤＡ培養基涂布平板，超凈臺上吹干，將平板置于２５℃培養７ ｄ，每個梯度重復３次，統計其出現真菌類型和數目，挑取不同類型的真菌單菌落于改良ＰＤＡ培養基平板劃線分離純化，斜面管４℃保存，用于分子鑒定和形態學鑒定。每克茶樣真菌數目計算公式為：Ｎ＝（菌落數÷稀釋倍數）×２０。

１．２．２分子鑒定采用１８Ｓ ｒＤＮＡ通用引物，用ＰＣＲ方法獲得１８Ｓ ｒＤＮＡ片段后進行測序（由上海英駿生物技術有限公司完成），將得到的堿基序列通過因特網在ＧｅｎＢａｎｋ等國際核酸序列數據庫內進行同源序列搜索，找出對應菌株與數據庫中同源性最高的模式菌株或保藏于ＡＴＣＣ或ＤＳＭ等國際菌種保藏中心的菌株［４］。

１．２．３平板形態特征鑒定平板上菌落形態觀察運用點植法，將接種針經火焰滅菌并待冷卻后，從斜面上挑取少量菌體，接種于相應平板的中間位置，將平板置于２５ ℃培養７～１４ ｄ，觀察菌落特征［５－７］。

１．２．４顯微形態特征鑒定用解剖針從培養皿的菌落上挑取少量菌體，置載玻片的水滴中，加蓋蓋玻片，于顯微鏡下觀察其形態特征［５－７］。

１．２．５菌株聚類分析運用Ｃｌｕｓｔａｌｗ軟件對獲得的菌株進行聚類分析。

２結果與分析

２．１真菌分離與計數

用改良ＰＤＡ培養基涂布平板２５ ℃培養７ ｄ，發現其出現真菌類型主要有５種，編號分別為２３０１、２４０１、３３０２、４３０４、５４０２（以這５個編號作為相應的菌株編號），對其進行計數統計，同時分別挑取這５種代表性菌落進行純培養用于后續的分子和形態學鑒定試驗。

由表１可知，５４０２型真菌為金湘益特制禮品茯磚茶的優勢真菌，每克茶樣中數目達４．９８×１０６個，２３０１、２４０１、３３０２、４３０４型真菌為非優勢真菌，較５４０２相差較明顯。由于２３０１、２４０１、３３０２、４３０４類型出現菌落數目較少，用平板梯度稀釋法分離計數具有很大的誤差，但這些類型的菌落存在數量是相當可觀的，說明它們在黑茶發酵中的作用和地位是不容忽視的，因此，我們對其進行分子和形態學鑒定研究，以便進一步了解黑茶發酵中的微生物作用。

２．２分子鑒定

獲得１８Ｓ ｒＤＮＡ片段后進行測序，將得到的堿基序列通過因特網在ＧｅｎＢａｎｋ等國際核酸序列數據庫內進行同源序列搜索，比對結果如下：

菌株２３０１與產紫青霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）及疣孢青霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍ）具有最高同源性，達９９．９％；菌株２４０１與光孢青霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｇｌａｂｒｕｍ）、產黃青霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、爪哇正青霉（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｊａｖａｎｉｃｕｍ）及Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ具有最高同源性，達９９．９％；菌株３３０２與Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｃｕａ、 Ｓａｇｅｎｏｍｅｌｌａ ｑｒｉｓｅｏｖｉｒｉｄｉｓ、多變擬青霉（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）、Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ ｚｏｌｌｏｒｎｉａｅ、黃絲衣霉（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ ｆｕｌｖａ）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ及青霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）具有最高同源性，達９９．９％；菌株４３０４與黃曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、米曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、寄生曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）及醬油曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）具有最高同源性，達１００.0％；菌株５４０２與蠟葉散囊菌（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ｈｅｒｂａｒｉｏｒｕｍ）、赤散囊菌（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ｒｕｂｒｕｍ）及灰綠曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ）具有最高同源性，達９９．８％。

２．３平板形態特征鑒定

菌株２３０１在查氏瓊脂平板上菌落培養７ ｄ，直徑約１．３ ｃｍ，平坦有幾道同心環紋，質地絨狀，培養１２ ｄ，分生孢子結構大量產生，分生孢子面暗灰綠色，菌絲體橘黃色，反面橘紅色，可溶性色素類似較淡的反面顏色且顯著突出（圖１）。在麥芽汁瓊脂平板上菌落培養７ ｄ，直徑約３．０ ｃｍ，平坦，有放射狀短紋，質地絨狀或兼有輕微絮狀，分生孢子結構大量產生，分生孢子面暗藍綠色，菌絲體淡黃色，反面紅褐色（圖１）。在查氏酵母膏瓊脂平板上菌落培養７ ｄ，直徑約１．８ ｃｍ，平坦，中心有臍狀突起而其他部位平坦，質地絨狀，分生孢子結構大量產生，分生孢子面暗灰綠色，菌絲體淡黃色，反面暗紅色（圖１）。

菌株２４０１在查氏瓊脂平板上菌落培養７ ｄ，直徑約２.0 ｃｍ，中間有臍狀突起，有溝紋，質地呈顯著的絨狀，分生孢子面藍綠色，菌絲體微黃色，反面黃褐色，可溶性色素顯著，類似反面稍淡的顏色（圖２）。在麥芽汁瓊脂平板上菌落培養７ ｄ，直徑３．５～４．５ ｃｍ，有少量放射狀皺紋，質地絨狀或兼有輕微絮狀，分生孢子面帶微灰藍綠色，在中部面近淡灰橄欖色，反面帶紅褐色（圖２）。在查氏酵母膏瓊脂平板上菌落培養７ ｄ，直徑２．５～３．０ ｃｍ，質地絨狀或兼有輕微絮狀，分生孢子面微灰淡藍綠色，菌絲體微黃色，反面黃褐色，可溶性色素淡黃色（圖２）。

菌株３３０２在查氏瓊脂平板上菌落培養７ ｄ，直徑２．５～３．０ ｃｍ，平坦，質地絨狀兼輕微絮狀，分生孢子結構較多，分生孢子面暗綠色，菌絲體粉色，反面杏黃色（圖３）。在查氏酵母膏平板瓊脂上菌落培養７ ｄ，直徑２．０～３．０ ｃｍ，平坦，質地絨狀兼絮狀，分生孢子結構較多，分生孢子面灰綠色，反面橘黃色（圖３）。在２０％蔗糖查氏瓊脂平板上菌落培養７ ｄ，直徑１．５～３．０ ｃｍ，平坦，質地絨狀兼絮狀，分生孢子結構灰綠色，有白色菌絲環繞，反面淺綠色（圖３）。

菌株４３０４在查氏瓊脂上菌落培養７ ｄ，直徑約３．５ ｃｍ，質地絲絨狀，中部稍現絮狀，具不明顯的溝紋，顏色初為黃綠色，而后變深，菌落反面微褐色，老化后產黃綠色色素（圖４）。在麥芽汁瓊脂平板上菌落培養７ ｄ，直徑約６．０ ｃｍ，質地絲絨狀，絮狀，暗草綠色，反面無色（圖４）。在查氏酵母膏瓊脂平板上菌落培養７ ｄ，直徑約５．０ ｃｍ，質地絲絨狀，中部有氣生菌絲，具輻射狀的溝紋，顏色為草綠色，反面無色至粉紅色（圖４）。

菌株５４０２在查氏瓊脂平板上菌落培養７ ｄ，直徑０．５～１．２ ｃｍ，平坦，分生孢子結構少，灰綠色，閉囊殼較多，黃色，反面棕褐色，產黑褐色色素（圖５）。在２０％蔗糖查氏瓊脂平板上菌落培養７ ｄ，直徑約２．０ ｃｍ，平坦或具皺紋，黃褐色，分生孢子結構灰綠色，閉囊殼大量形成，有橙褐色菌絲環繞，反面棕黃色（圖５）。在４０％蔗糖麥芽汁瓊脂平板上菌落生長迅速，培養７ ｄ，直徑約５．０ ｃｍ，氣生菌絲明顯，分生孢子結構較多，呈灰綠色，反面帶橙褐色（圖５）。

２．４顯微形態鑒定

菌株２３０１：分生孢子梗莖（８０．０～２５０．０）μｍ×（２．５～３．２）μｍ，短平滑，頂端通常膨大；帚狀枝雙輪生，偶有三輪生或單輪生，彼此緊貼而近于平行；梗莖每輪４～８個，（９．０～１３．０）μｍ×（２．５~３．０）μｍ；瓶梗每輪４～６個，披針形，梗頸明顯；分生孢子呈現橢圓形，充分成熟時部分呈現近球形，（２．８～３．５）μｍ×（２．２～３．０）μｍ，壁平滑（圖６）。

菌株２４０１：帚狀枝三輪生，少量雙輪生，彼此稍叉開或叉開；副枝１～２個，（１２．０～２０．０）μｍ×（２．５～３．４）μｍ；梗基每輪２～５個，（１０．０～１３．０）μｍ×（２．５～３．０）μｍ；瓶梗每輪４～８個，（７．０～９．０）μｍ×（２．０～２．５）μｍ，瓶狀；分生孢子呈現橢圓形或近球形，（３．０～３．５） μｍ×（２．５～３．０）μｍ，壁平滑（圖６）。

菌株３３０２：帚狀枝雙輪生，偶有三輪生或單輪生，彼此通常稍叉開，也有緊貼近于平行者；梗基每輪５～９個，（９．０～１４．０）μｍ×（２．０～２．７）μｍ；瓶梗每輪４～８個，（８．０～１２．０）μｍ×（１．０～２．５）μｍ，披針形，梗頸短；分生孢子呈現球形或近球形，２．５～３．５ μｍ，呈小疣狀粗糙（圖６）。

菌株４３０４：分生孢子幼時為球形，后成輻射形，分生孢子梗莖（１４０．０～７００．０）μｍ×（４．８～１１．０）μｍ，壁近于光滑或有時在頂囊處現粗糙，頂囊近球形，小者棒形，１３～４１ μｍ，產孢結構單層，分生孢子球形或近球形，４．２～６．０ μｍ，具粗疏小刺（圖６）。

菌株５４０２：閉囊殼球形或近球形，１２～１６ μｍ，子囊孢子雙凸鏡形，（６～８）μｍ×（４～６）μｍ，“赤道”部分具明顯但較淺的溝，兩側有脊，凸面光滑（圖６）。

２．５聚類結果分析

對獲得的５株菌株的１８Ｓ ｒＤＮＡ序列進行聚類分析，結果表明它們與優勢菌的種間有一定差異（圖７）。

３結論與討論

結合１８Ｓ ｒＤＮＡ片段的序列和形態學鑒定結果，經廣東省微生物分析檢測中心鑒定（粵微檢（２００９）ＺＤ０３９８號）確認：

菌株２３０１的１８Ｓ ｒＤＮＡ序列與Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ同源性高達９９．９％，其形態特征與Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ最相似。菌株２４０１的１８Ｓ ｒＤＮＡ序列與Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ同源性高達９９．９％，其形態特征與Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ最相似。菌株３３０２的１８Ｓ ｒＤＮＡ序列與Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．同源性高達９９．９％，其形態特征與Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．最相似。菌株４３０４的１８Ｓ ｒＤＮＡ序列與Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ同源性高達１００.0％；其形態特征與Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ最相似。菌株５４０２的１８Ｓ ｒＤＮＡ序列與Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ｈｅｒｂａｒｉｏｒｕｍ同源性高達９９．８％，其形態特征與Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ｈｅｒｂａｒｉｏｒｕｍ最相似。

本研究采用改良ＰＤＡ培養基，對２００７年產金湘益特制禮品茯磚茶，采用平板梯度稀釋法分離獲得的真菌２３０１、２４０１、３３０２、４３０４、５４０２，運用分子和形態學鑒定相結合的方法對其進行了種的鑒定。

首先，從中分離的優勢菌經我們鑒定為蠟葉散囊菌，與傳統認為的冠突散囊菌（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ｃｒｉｓｔａｔｕｍ）［１，２］有差異，可能是由于我們對優勢菌的挑取只是隨機選擇一個單菌落，而蠟葉散囊菌和冠突散囊菌屬于相近的真菌種，Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ｃｒｉｓｔａｔｕｍ １８Ｓ ｒＤＮＡ登錄號ＡＢ００２０７３．１，與Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ｈｅｒｂａｒｉｏｒｕｍ １８Ｓ ｒＤＮＡ相似度為９９％，我們重復了培養結果，與湖南農業大學分離的冠突散囊菌生長比較，在ＰＤＡ培養基上生長的菌落形態特征基本上不能區分，故有可能存在較大的誤差。當然，也有可能是不同茯磚茶種類中，其優勢菌本身就存在差異，是散囊菌的生理小種或變異種，這有待進一步的研究。由于不同茯磚茶種類中優勢菌存在差異，說明很有必要對不同茯磚茶種類進行比較研究，建立黑茶優勢菌種質資源庫，以期更好地提升黑茶品質，發揮黑茶應有的作用。

另外，我們用平板梯度稀釋法也分離到了２３０１、２４０１、３３０２、４３０４等非優勢菌，它們分別屬于不同的青霉屬和曲霉屬，對其１８Ｓ ｒＤＮＡ序列進行聚類分析，也表明它們與優勢菌的種間有一定差異。盡管我們在挑取單菌落進行分離純化存在偶然性，但它們在黑茶發酵中是普遍存在的，因為我們３次重復都能找到類似特征菌落。這從另外一方面也說明了黑茶發酵中微生物是一個多菌株種類、協同作用的結果，有必要從微生物生態系統角度對黑茶深入進行，通過對黑茶發酵環境微生物群落的種群結構和多樣性進行深入探查并研究其動態變化，可以為優化黑茶發酵群落結構、調節群落功能和發現新的重要微生物功能類群提供可靠的依據。

參考文獻：

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