香菇多糖對黃顙魚免疫細胞活性的影響

摘要：試驗選取５４０尾黃顙魚（Ｐｅｌｔｅｏｂａｇｒｕｓ ｆｕｌｖｉｄｒａｃｏ），對其連續投喂含不同水平香菇多糖（Ｌｅｎｔｉｎａｎ，ＬＮＴ）的配合飼料８周。采用Ｐｅｒｃｏｌｌ密度梯度離心等技術，對黃顙魚頭腎巨噬細胞與外周血白細胞進行分離純化，使用ＮＢＴ還原法、Ｇｒｉｅｓｓｅ試劑顯色法與ＭＴＴ法測定頭腎巨噬細胞呼吸爆發活性與外周血白細胞的增殖能力，以探討香菇多糖對黃顙魚免疫細胞活性的影響。結果表明香菇多糖各水平組均能提高黃顙魚頭腎巨噬細胞的氧呼吸爆發活性，且１ ２００～１ ５００ ｍｇ／ｋｇ水平組提高作用極顯著（Ｐ＜０．０１）；香菇多糖各水平組能提高黃顙魚頭腎巨噬細胞氮呼吸爆發活性，其中６００ ｍｇ／ｋｇ水平組活性顯著提高（Ｐ＜０．０５），９００～１ ５００ ｍｇ／ｋｇ水平組活性提高效果極顯著（Ｐ＜０．０１）；投喂香菇多糖還能顯著提高黃顙魚外周血白細胞的增殖能力（Ｐ＜０．０５），且６００～１ ５００ ｍｇ／ｋｇ水平組促進作用極顯著（Ｐ＜０．０１）。可見，香菇多糖可以有效地提高黃顙魚免疫細胞的活性。

關鍵詞：黃顙魚；香菇多糖；免疫細胞活性；呼吸爆發；細胞增殖

中圖分類號： Ｒ９７９．５ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）09－1855-04

Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｌｅｎｔｉｎａｎ ｏｎ ｔｈｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｙｅｌｌｏｗ Ｃａｔｆｉｓｈ （Ｐｅｌｔｅｏｂａｇｒｕｓ ｆｕｌｖｉｄｒａｃｏ）

ＢＡＩ Ｄｏｎｇ－ｑｉｎｇ，ＷＵ Ｘｕａｎ，ＺＨＵ Ｇｕｏ－ｘｉａ，ＮＩＮＧ Ｂｏ

（Ｔｉａｎｊｉｎ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ＡＱＵ－Ｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｔｅａｃｈｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｔｉａｎｊｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｔｉａｎｊｉｎ ３００３８４， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： ５４０ ｙｅｌｌｏｗ ｃａｔｆｉｓｈ（Ｐｅｌｔｅｏｂａｇｒｕｓ ｆｕｌｖｉｄｒａｃｏ） ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｆｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ｌｅｎｔｉｎａｎ ｆｏｒ ８ ｗｅｅｋｓ． Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｈｅａｄ ｋｉｄｎｅｙ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ ｏｆ ｙｅｌｌｏｗ ｃａｔｆｉｓｈ ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｂｙ Ｐｅｒｃｏｌl ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ． Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ， ＮＢＴ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ， Ｇｒｉｅｓｓe ｒｅａｇｅｎｔ colorimetry ａｎｄ ＭＴＴ ａｓｓａｙ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｂｕｒｓｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｅａｄ ｋｉｄｎｅｙ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｄｉｓｃｕｓｓ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＬＮＴ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｙｅｌｌｏｗ ｃａｔｆｉｓｈ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｏｘｙｇｅｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｂｕｒｓｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｅａｄ ｋｉｄｎｅｙ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｗａｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｔ ａｌｌ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＬＮＴ； ａｎｄ ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ between １ ２００ ｍｇ／ｋｇ ａｎｄ １ ５００ ｍｇ／ｋｇ（Ｐ＜０．０１）． Ｔｈｅ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｂｕｒｓｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｌｌ ｔｈｅ ＬＮＴ ｇｒｏｕｐｓ ｗａｓ ａｌｓｏ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ， and 600 ｍｇ／ｋｇ LNT level increased significantly（Ｐ＜０．０5）， ａｎｄ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｔ ９００~１ ５００ ｍｇ／ｋｇ ＬＮＴ ｌｅｖｅｌ（Ｐ＜０．０１）． Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ ｏｆ ａｌｌ ｔｈｅ ＬＮＴ ｇｒｏｕｐｓ ｗａｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ（Ｐ＜０．０5）； ａｎｄ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｆｒｏｍ ６００ ｍｇ／ｋｇ ｔｏ １ ５００ ｍｇ／ｋｇ（Ｐ＜０．０１）． Ｉｎ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ， ＬＮＴ ｃｏｕｌｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｙｅｌｌｏｗ ｃａｔｆｉｓｈ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｙｅｌｌｏｗ ｃａｔｆｉｓｈ（Ｐｅｌｔｅｏｂａｇｒｕｓ ｆｕｌｖｉｄｒａｃｏ）； Ｌｅｎｔｉｎａｎ（ＬＮＴ）； ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｅｌｌｓ； ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｂｕｒｓｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ； ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ

隨著人們對水產品質量要求的不斷提高與治療用抗生素長期使用導致養殖品種耐藥性增強兩者間矛盾的深化，尋求一種低毒、安全、高效的新型免疫增強劑替代藥物，已經成為水產養殖領域中的重要任務。香菇多糖（Ｌｅｎｔｉｎａｎ，ＬＮＴ）是從香菇子實體中分離出的天然活性成分［１］，并因其具有良好的抗腫瘤、抗病毒、調節機體免疫力、刺激干擾素形成等功效逐漸引起了人們的關注。但目前，關于使用香菇多糖增強機體免疫力的研究還主要集中在臨床與畜禽養殖中，在水產動物中使用甚少，而在黃顙魚（Ｐｅｌｔｅｏｂａｇｒｕｓ ｆｕｌｖｉｄｒａｃｏ）中還未見報道。基于此，本研究選取優質經濟魚類——黃顙魚作為研究對象，對其投喂含不同水平香菇多糖的配合飼料，通過檢測其頭腎巨噬細胞的呼吸爆發活性與外周血白細胞的增殖能力，尋求適宜的添加水平，并為日后黃顙魚疾病防治及免疫增強劑的開發提供理論依據。

１材料和方法

１．１試驗材料

１．１．１試驗用魚及養殖條件２齡健康黃顙魚５４０尾取自天津農學院養殖漁場，平均體重（６１．８±２．０）ｇ，平均體長（１９．５±２．０）ｃｍ。試驗魚飼養于架設在養殖池中的１．５ ｍ×１．５ ｍ×１．０ ｍ的１８個網箱中，每箱隨機投放黃顙魚３０尾（雌雄各半）。香菇多糖以３００、６００、９００、１ ２００、１ ５００ ｍｇ／ｋｇ ５個水平添加于飼料中，每組３個平行，以不添加多糖的基礎飼料（粗蛋白３８．１４％，粗灰分１２．３７％，粗脂肪３．０８％，水分１２．３６％）為對照。試驗期間水溫保持在（２６±２）℃，每天連續充氧，試驗期間每天換水１／３左右。日投餌率為２％，每日投喂３次。

１．１．２多糖的制備試驗用香菇多糖粗提物（純度５０％）購于陜西方晟生物科技公司，粗多糖采用Ｓｅｖａｇｅ法［２］去除蛋白，并采用ＤＥＡＥ－纖維素柱層析和Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２００凝膠柱進一步純化香菇多糖［３］，最終采用苯酚－硫酸法［４］測定多糖的有效含量。香菇多糖經過逐步分離純化后，最終的純度大于９０％。

１．１．３試劑Ｌ－１５培養基、脂多糖（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＬＰＳ）、Ｈａｎｋｓ溶液、佛波豆寇乙酸酯（Ｐｈｏrｂｏｌ Mｙｒｉｓｔａｔｅ Aｃｅｔａｔｅ，ＰＭＡ）、硝基藍四氮唑（ＮＢＴ），肝素鈉、超氧化物歧化酶標準品和噻唑蘭［３－（４，５－Ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）－２，５－ｄｉｐｈｅｎｙｌ－２Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ，ＭＴＴ］購于Ｓigma公司；新生小牛血清購自Ｇibco公司。鏈霉素／青霉素購于北京鼎國生物技術有限責任公司。硅石－聚乙烯吡咯烷酮（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ，Pｅｒｃｏｌｌ）、細胞培養板購于Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司；Ｇｒｉｅｓｓ試劑購于上海碧云天生物技術有限公司。

１．２試驗方法

１．２．１黃顙魚頭腎巨噬細胞與外周血白細胞的分離使用ＭＳ-２２２麻醉后，采用Ｂａｙｎｅ法［５］分離黃顙魚頭腎巨噬細胞。使用Ｐｅｒｃｏｌｌ密度梯度法［６］分離頭腎巨噬細胞，并使用臺盼藍進行細胞活性檢測并計數，以確保活細胞的數量大于９０％，調整細胞濃度為１．０×１０７個／ｍＬ。２７ ℃培養備用。在無菌的條件下進行尾靜脈抽血，外周血白細胞的分離方法同頭腎巨噬細胞。

１．２．２免疫細胞活性指標檢測頭腎巨噬細胞氧呼吸爆發活性的測定采用ＮＢＴ法［７］。每個多糖水平組細胞設８個平行，以添加ＬＰＳ（５００ μｇ／ｍＬ）的細胞液作為陽性對照，以檢測細胞在培養過程中的活性。使用Ｔｈｅｒｍ ３００１型酶聯免疫檢測儀，在６２０ ｎｍ下，測定吸光值。頭腎巨噬細胞氮呼吸爆發活性的測定采用Ｇｒｉｅｓｓ試劑法［８］，其他操作同氧呼吸爆發活性測定。在５４０ ｎｍ下測定吸光值。外周血白細胞的增殖采用ＭＴＴ法［９］檢測，每個多糖水平組細胞設１２個平行，以添加ＬＰＳ（５００ μｇ／ｍＬ）的細胞液作為陽性對照，培養２４ ｈ后，在５７０ ｎｍ下測定各孔光吸收值，記錄結果。每個指標檢測中每個水平均檢測６尾魚。

１．２．３數據處理試驗數據用平均值±標準誤表示，數據分析采用ＳＰＳＳ１７．０軟件包中的單因素方差分析（ｏｎｅ－ｗａｙ－ＡＮＯＶＡ）。

２結果與分析

２．１香菇多糖對黃顙魚頭腎巨噬細胞氧呼吸爆發活性的影響

連續投喂黃顙魚含不同水平香菇多糖的飼料８周后，檢測其頭腎巨噬細胞氧呼吸爆發活性發現：較高濃度的ＬＰＳ（陽性對照）能顯著提高頭腎巨噬細胞氧呼吸爆發活性（Ｐ＜０．０１），這說明試驗中培養的細胞狀態良好；與空白對照組相比，各水平香菇多糖均能提高黃顙魚頭腎巨噬細胞的氧呼吸爆發活性，在１ ２００～１ ５００ ｍｇ／ｋｇ水平時提高作用極顯著（Ｐ＜０．０１）；其中１ ２００ ｍｇ／ｋｇ和１ ５００ ｍｇ／ｋｇ組間差異不大（Ｐ＞０．０５）（圖１，表１）。從提高黃顙魚頭腎巨噬細胞氧呼吸爆發活性的角度考慮，飼料中香菇多糖的適宜添加量為１ ２００ ｍｇ／ｋｇ。

２．２香菇多糖對黃顙魚頭腎巨噬細胞氮呼吸爆發活性的影響

用不同水平的香菇多糖飼料投喂黃顙魚８周后，測定各組黃顙魚頭腎巨噬細胞氮呼吸爆發活性。與圖１相似，陽性對照組（ＬＰＳ組）巨噬細胞氮呼吸爆發活性明顯提高（Ｐ＜０．０１）；黃顙魚頭腎巨噬細胞氮呼吸爆發活性隨香菇多糖水平的增加而提高。與空白對照相比，除３００ ｍｇ／ｋｇ多糖組氮呼吸爆發活性提高不明顯外，其余各組氮呼吸爆發活力依次分別提高２３．９４％（Ｐ＜０．０５），３４．２９％、５７．８％、７１．５％（Ｐ＜０．０１），且1200 ｍｇ／ｋｇ和1500 ｍｇ／ｋｇ水平組間活性變化不大（Ｐ＞０．０５）（圖2，表１）。從頭腎巨噬細胞氮呼吸爆發活性提高角度分析，選擇１ ２００ ｍｇ／ｋｇ香菇多糖水平添加到飼料中較適宜。

２．３香菇多糖對黃顙魚外周血白細胞增殖的影響

用含有不同水平的香菇多糖飼料投喂黃顙魚８周后，黃顙魚外周血白細胞增殖活性明顯提高，陽性對照組（ＬＰＳ作用組）外周血白細胞增殖明顯提高；與空白對照組相比，各多糖水平組黃顙魚外周血白細胞增殖能力依次分別提高１．４（Ｐ＜０．０５）、２．３、２．６、３．４與４．０倍（Ｐ＜０．０１），且１ ５００ ｍｇ／ｋｇ水平組的增殖能力高于陽性對照組（Ｐ＜０．０１），（見圖３，表１）。可見，從提高黃顙魚外周血白細胞增殖角度考慮，飼料中添加香菇多糖適宜水平為１ ２００～１ ５００ ｍｇ／ｋｇ。

３討論

３．１香菇多糖提高免疫細胞活性的作用機理

香菇多糖具有能抵抗多種細菌、病毒和寄生蟲入侵的免疫學活性，這種免疫作用并非直接攻擊病原體，而是通過激活免疫細胞，促使其成熟、分化和增殖，改善機體平衡，從而達到增強機體自身免疫作用的目的［１０］。其提高免疫細胞活性作用機理可以概括為以下兩點：①香菇多糖具有活化巨噬細胞的作用，而活化后的巨噬細胞可分泌活性氧、一氧化氮、白介素等與免疫應答及炎癥有關的生物活性物質。②香菇多糖是一種胸腺依賴型Ｔ細胞導向并有巨噬細胞參與的特殊免疫佐劑［１１］，可以促進淋巴細胞活化因子（ＬＡＥ）產生，刺激或恢復輔助性Ｔ細胞活性功能，提高淋巴細胞轉化率，促進抗體形成，也可被稱為免疫復原物質。

３．２香菇多糖對動物免疫細胞活性的影響

國內外學者在香菇多糖提高陸上動物機體免疫細胞活性方面已進行了一定的研究，但在水產動物上的研究相對較少，尤其是在黃顙魚中的使用尚未見報道。體外培養時，香菇多糖能明顯促進鯉魚頭腎巨噬細胞的氧呼吸爆發活性，且１００ μｇ／ｍＬ濃度組效果最佳；能極顯著地提高鯉魚外周血白細胞的增殖能力；但對氮呼吸爆發活性影響不大，且存在高濃度抑制現象［１２］。香菇多糖協同ＣｏｎＡ或ＬＰＳ能顯著促進小鼠脾淋巴細胞的增殖［１３］；還可誘導小鼠腹腔巨噬細胞ＮＯ生成量增加，并可增高ｉＮＯＳ活性，且呈明顯的劑量依賴關系［１４，１５］。體內注射香菇多糖能明顯提高荷瘤小鼠外周血白細胞的總數，尤以淋巴細胞數增加最為顯著［１６］。投喂香菇多糖可提高雞血液中淋巴細胞的轉化水平［１７］；靜脈注射香菇多糖還可以增加小鼠與家兔因放、化療而減少的白細胞數量［１８］。本試驗中口服香菇多糖能促進黃顙魚頭腎巨噬細胞氧呼吸爆發活性和外周血白細胞的增殖能力，這與上述研究結果相互印證，而本試驗中頭腎巨噬細胞氮呼吸爆發活性與香菇多糖量存在明顯的劑量依賴關系，高濃度組作用極顯著，這與曹麗萍等［１２］研究結果不符，究其原因可能是與魚的種類、香菇多糖添加方式或添加劑量不同有關。

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