一株產生抑菌氣體內生真菌的拮抗活性評價

摘要：ＨＮＤ５是一株分離自臂形草的內生真菌，對其拮抗作用評價結果表明，該菌株能夠產生對１１株病原真菌有較好拮抗作用的揮發性氣體，對峙培養表明其對這些菌株有較好拮抗作用，而其無菌濾液僅對部分病原真菌有一定的拮抗作用，揮發性氣體可能是其抑菌作用的主要機制。

關鍵詞：植物內生真菌；抑菌氣體；拮抗活性

中圖分類號：S482.2+92 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）09－1803-03

Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ａｎ Ｅｎｄｏgeneｔｉｃ Ｆｕｎｇｉ Generating Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｇａｓ

ＳＨＩ Ｔａｏ，ＨＵＡＮＧ Ｇｕｉ－ｘｉｕ

（Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， ＣＡＴＡＳ ／ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ

Ｆｏｒｅｓｔ Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ａｌｉｅｎ Ｐｅｓｔｓ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｃｈｉｎａ，Ｄａｎｚｈｏｕ，５７１７３７， Ｈａｉｎａｎ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： ＨＮＤ５ ｉｓ ａｎ ｅｎｄｏgeneｔｉｃ ｆｕｎｇｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｂｒａｃｈｉａｒｉａ ｂｒｉｚａｎｔｈａ， ｔｈｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｅｖａｌｕａｔｅｄ and tｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｇａｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ＨＮＤ５ had ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｎ １１ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｕｎｇｉ． Ｉｎ ｃｏｎｆｒｏｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ， ＨＮＤ５ ｈａｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅｓｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｕｎｇｉ， ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｇｅｒｍｆｒｅｅ ｆｉｌｔｒａｔｅ ｏｆ ＨＮＤ５ ｈａｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｎ only ３ ｓｔｒａｉｎｓ， ｓｏ ｔｈｅ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｇａｓ ｐｌａｙed ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｅｎｄｏgeneｔｉｃ ｆｕｎｇｕｓ； ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｇａｓ； ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ

內生真菌是指生活史的部分階段或者整個生活史均生活在植物體內，且對植物組織沒有引起明顯癥狀的真菌［１］。

內生真菌和宿主植物之間為互利共生關系，后者能夠為內生真菌提供生存空間、水分和養分，保護其不受外界環境的影響，使其可以在宿主體內長期存在，而內生真菌可以分泌有益活性產物而對宿主起到促生、抗逆境等作用。拮抗性內生真菌能夠產生抑菌活性物質，和宿主植物一起作為一個“共生體”而抵御外界病原物的侵染，起到類似抗病基因的作用。由于宿主植物的保護作用，拮抗性內生真菌在應用于生防時其防效穩定性和持久性得到了很大的提高，因而成為當前植物病理學家研究的一個熱點。

ＨＮＤ５是一株分離自臂形草的枝頂孢屬（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）內生真菌［２］，研究表明該菌對芒果炭疽病菌、香蕉枯萎病菌和水稻稻瘟病菌有較強的拮抗作用，而且具有內生性。在前期研究的基礎上，我們選取了１１株熱帶地區常見的病原真菌，采用３種方法對該菌株的拮抗活性進行評價，現將研究結果報告如下。

１材料與方法

１．１試驗材料

１．１．１供試菌株病原真菌芒果炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、香蕉炭疽病菌、竹子枯萎病菌、橡膠樹炭疽病菌、橡膠樹多主棒孢病菌、木瓜棒孢霉病菌、臂形草葉斑病菌、水稻稻瘟病菌、水稻胡麻葉斑病菌、甘蔗赤腐病菌和內生真菌ＨＮＤ５，均由中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所提供。

１．１．２供試培養基菌株培養選用ＰＤＡ培養基，配方參見文獻［３］。

１．２試驗方法

１．２．１菌株準備ＨＮＤ５和各病原真菌均在ＰＤＡ平板上培養７ ｄ后，用滅菌打孔器在菌落邊緣打取直徑４ ｍｍ的菌餅備用。

１．２．２拮抗活性評價方法

１）平板對峙法。在直徑９ ｃｍ的培養皿中倒入２０ ｍＬ融化的ＰＤＡ培養基，制備同樣厚度的平板，在中央接種各病原真菌菌餅，在距離３ ｃｍ處接種ＨＮＤ５菌餅，以不接ＨＮＤ５處理為對照。２８ ℃培養７ ｄ后觀察并測量菌落直徑，重復３次。

２）帶毒平板法。打取２個ＨＮＤ５菌餅，接種１００ ｍＬ液體ＰＤＡ培養基，２８ ℃，１８０ ｒ／ｍｉｎ培養７ ｄ，再在同樣條件下按１∶２５的比例擴大培養１４ ｄ，最后在２８ ℃靜置暗培養１４ ｄ。離心取上清液，制備無菌濾液（用液體ＰＤＡ調ＯＤ６００nm值０．４～０．５），按照體積比１∶１０制備帶毒ＰＤＡ平板，在中央接種各病原真菌菌餅，以不加菌液為對照，２８ ℃培養７ ｄ后觀察并測量菌落直徑，重復３次。

３）雙皿對峙法。制備直徑為９ ｃｍ的ＰＤＡ培養基平板，接種ＨＮＤ５后２８ ℃培養１５ ｄ，輕輕將皿蓋移去。在新制備的ＰＤＡ平板中央接種各病原菌菌餅，將其倒扣在已培養好的、帶有ＨＮＤ５的皿底上，用Ｐａｒａｆｉｌｍ膜封口，２８ ℃共培養７ ｄ，以同時接種的病原菌為對照，重復３次。

各種方法的抑菌率均按以下公式計算：

抑菌率＝（對照菌落直徑－各處理菌落直徑）／（對照菌落直徑－原菌餅直徑）×１００％。

２試驗結果

２．１ＨＮＤ５對病原真菌的平板對峙拮抗作用

平板對峙試驗結果（圖１，表１）表明，ＨＮＤ５對供試的８種病原真菌均具有較強的拮抗活性，抑菌距離達到０．４～１．４ ｃｍ，抑菌率為（５４．６±１．１）％～（９１．０±３．４）％。

２．２ＨＮＤ５無菌濾液對病原真菌的拮抗作用

采用帶毒平板法評價了ＨＮＤ５的無菌濾液對病原真菌的拮抗作用，結果表明無菌濾液抑菌作用較差，僅對臂形草葉斑病、木瓜棒孢和水稻胡麻葉斑病菌具有一定的抑制作用，抑制率分別為（３６．８±２．６）％、（４２．２±１．８）％和（５１．６±３．１）％，圖２為ＨＮＤ５無菌濾液對臂形草葉斑病菌的拮抗作用。

２．３ＨＮＤ５所產生活性氣體對病原真菌的拮抗作用

采用雙皿對峙法評價了ＨＮＤ５所產生活性氣體的抑菌作用，結果（圖３，表２）表明其對１１種病原真菌都有抑菌作用，其抑菌率為（５８．８±１．２）％～（８６．７±２．２）％（表２）。

３結論與討論

本實驗室的前期研究結果表明，ＨＮＤ５對芒果炭疽病菌、香蕉枯萎病菌和水稻稻瘟病菌均有較好的拮抗作用，本研究的平板對峙試驗和雙皿對峙試驗均表明該菌株對包括這３種病菌在內的１１種病原真菌有較好的拮抗作用。枝頂孢屬（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）中的很多種都是常見的內生真菌，廣泛分布于禾本科旗草［４］、臂形草和木本的沙棘［５］、麻瘋樹［６］、見血封喉［７］等植物組織內。本實驗室已證明ＨＮＤ５能夠內生于臂形草［２］，該菌株對１１種我國熱帶地區常見植物病害的病原菌均有較好的拮抗作用，表明其在熱區植物病害生防中有較廣泛的應用范圍。

平板對峙和雙皿對峙結果均表明ＨＮＤ５對１１種病原真菌有較好的拮抗作用，而其無菌濾液僅對臂形草葉斑病、木瓜棒孢和水稻胡麻葉斑病菌有一定的拮抗作用。分析ＨＮＤ５產生的抑菌作用物質，除揮發性氣體外，還有部分分泌于培養液中。ＨＮＤ５的無菌濾液僅對３種病原真菌有一定的拮抗作用，表明揮發性抑菌氣體在其拮抗作用中起主要作用。

對于揮發性抑菌氣體的研究，目前國內外植物源方面的研究較多，而關于真菌所產生的揮發性抑菌氣體則研究很少。張薇等［８］對銀杏、桂花、懸鈴木等２０種園林植物進行了研究，發現它們能產生間羥基苯甲酸（Ｍ－ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、水楊酸甲酯（Ｍｅｔｈｙｌ ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ）、鄰苯二酚（Ｃａｔｅｃｈｏｌ）等多種揮發性抑菌物質。關于真菌所產生的揮發性抑菌氣體，分離自錫蘭肉桂的內生真菌Ｍｕｓｃｏｄｏｒ ａｌｂｕｓ研究的較多。該菌可以產生揮發性活性天然氣體化合物，這種化合物不但可以高度有效地防治植物病原真菌和細菌，而且對許多人類病原微生物具有強有力的抑制活性。２００２年，美國ＡｇｒｅＱｕｅｓｔ公司以該菌株為基礎，獨家推出世界上第一種能夠提高植物抗真菌病害能力的真菌熏蒸劑［９］。本研究通過雙皿對峙法發現ＨＮＤ５菌株能夠產生有較強抑菌作用的揮發性氣體，也為我國新型生物源農藥的研制提供了菌源。

參考文獻：

［１］ ＳＥＵＴＴ Ｈ，ＭＩＣＨＡＥＬ Ｊ，ＫＡＲＹＮ Ｓ，ｅｔ ａ１． Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｐｌａｎｔａ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｌｌ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｕｓ［Ｊ］.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９７，１４３：２６７－２７５．

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［４］ ＫＥＬＥＭＵ Ｓ，ＷＨＩＴＥ Ｊ Ｆ，ＭＵＩＯＺ Ｆ， ｅｔ ａｌ． Ａｎ ｅｎｄｏｐｈｙｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒｏｐｉｃａｌ ｆｏｒａｇｅ ｇｒａｓｓ Ｂ ｒａｃｈｉａｒｉａ ｂｒｉｚａｎｔｈａ： ｉｓｏｌａｔｉｎｇ， ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ， ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｆｕｎｇｕｓ，ａｎｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｉｔｓａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ［Ｊ］ ， Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，４７：５５２．

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［６］ 袁理春，趙琪， 張克華， 等． 麻瘋樹根部內生真菌分離及鑒定［Ｊ］． 西南農業學報，２００９，２２（１）：９５－９８．

［７］ 闕東枚，戴好富，曾艷波，等．見血封喉內生真菌Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ. Ｊ１化學成分研究［Ｊ］．中國藥物化學雜志，２００９，１９（３）：２００－２０５．

［８］ 張薇，程政紅，劉云國，等． 植物揮發性物質成分分析及抑菌作用研究［Ｊ］．生態環境，２００７，１６（３）：１４５５－１４５９．

［９］ 汪開． 美國ＡｇｒeＱｕｅｓｔ生物技術公司首次推出真菌熏蒸劑［Ｊ］．生物技術通報，２００３（４）：５１．