抗速滅威噬菌體單鏈抗體庫的構建\\篩選及鑒定

摘要：以速滅威抗原免疫的小鼠為實驗對象，取其脾細胞，ＲＴ－ＰＣＲ擴增抗體重鏈可變區（ＶＨ）和輕鏈可變區（ＶＬ）基因，重疊延伸ＰＣＲ拼接單鏈抗體（ＳｃＦｖ）基因，克隆入噬菌粒表達載體ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ并轉化大腸桿菌ＴＧ１，成功構建了庫容約７．６×１０５的抗速滅威噬菌體ScFv庫。對該文庫進行了５輪“吸附-洗脫-擴增”的富集篩選，獲得了６個特異性較強的抗速滅威噬菌體ＳｃＦｖ陽性克隆。其研究結果為速滅威特異性抗體的大量制備奠定了一定的基礎。

關鍵詞：速滅威；單鏈抗體；噬菌體展示

中圖分類號：Ｑ８１９ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）09－1908-05

Construction，Screening and Identification of Phage ScFv Library Against Metolcarb

ＬＩ Ｔｉｅ－ｊｕｎ１，ＬＩ Ｄｅ－ｑｕａｎ２

（１． Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎａｎｔｏｎｇ Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｎａｎｔｏｎｇ ２２６００７，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ；

２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｎａｎｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｔｏｎｇ ２２６００７，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｂａｌｂ／Ｃ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｈａｐｔｅｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｏｆ Ｍｅｔｏｌｃａｒｂ， ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｓｐｌｅｅｎ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｈａｒｖｅｓｔｅｄ． ＶＨ ａｎｄ ＶＬ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ． ＶＨ ａｎｄ ＶＬ ｗｅｒｅ matched into ScFc by overlap extension PCR， ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ， ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍed ＴＧ１ ｃｅｌｌｓ． Ｔｈｕｓ ｔｈｅ ｐｈａｇｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ（ＳｃＦｖ） ｌｉｂｒａｒｙ ｗｉｔｈ ａ ｓｉｚｅ ｏｆ ａｂｏｕｔ ７．６×１０５ was ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ． Ｔｈｅ ｌｉｂｒａｒｙ ｗａｓ ｂｉｏｐａｎｎｅｄ ｂｙ ５ ｒｏｕｎｄｓ ｏｆ ｂｉｎｄｉｎｇ－ｅｌｕｔｉｏｎ－ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ； ａｎｄ ６ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｌｏｎｅｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ Ｍｅｔｏｌｃａｒｂ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｍｅｔｏｌｃａｒｂ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍｅｔｏｌｃａｒｂ；ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ（SｃＦｖ）； ｐｈａｇｅ－ｄｉｓｐｌａｙ

速滅威（Ｍｅｔｏｌｃａｒｂ，３－甲苯基－Ｎ－甲基氨基甲酸酯）是氨基甲酸酯類殺蟲劑，具有觸殺和熏蒸作用，主要用于稻田、蔬菜、水果及經濟作物等的害蟲防治。雖然速滅威為中等毒殺蟲劑，但農產品上殘留的速滅威仍會對人體健康造成潛在的危害，有必要對其進行持續的監控檢測［１］。

目前定量分析速滅威殘留的主要方法是氣相色譜（ＧＣ）和高效液相色譜（ＨＰＬＣ）等儀器分析法，但這些方法必須對樣品進行步驟冗長的純化處理，很難達到快速、簡便的現場檢測要求；與儀器分析相比，免疫分析法具有快速、簡單、靈敏、價廉等優點，可用于現場快速檢測，具有廣闊的應用前景和開發潛力［２］。

抗體作為免疫分析的核心試劑，其制備技術一直是制約免疫分析法在農藥殘留分析領域應用的瓶頸因素。與傳統的多抗和單抗制備技術相比，第三代抗體制備技術——噬菌體抗體庫技術具有基因型與表型相統一、選擇與擴增相統一的優點，它不僅可以繞過繁瑣的雜交瘤制備過程，甚至可以省略動物免疫的步驟，使得建立各種文庫以及體外篩選任何目的分子的重組抗體成為可能［３］。因此，噬菌體抗體庫技術為化學農藥抗體的制備開拓了新的思路。

本研究利用噬菌體展示技術，構建抗速滅威噬菌體ＳｃＦｖ庫，從中篩選與速滅威特異性結合的噬菌體ＳｃＦｖ陽性克隆，為進一步實現速滅威免疫快速檢測提供大量制備特異性抗體的新途徑。目前，國內外有關速滅威ＳｃＦｖ制備的研究尚未見報道。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１實驗動物ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，雌性，６周齡，由南通大學實驗動物中心提供。

１．１．２主要試劑速滅威免疫原ＨＯＭ－ＢＳＡ和包被抗原ＨＯＭ－ＯＶＡ參照文獻［２］的步驟合成；弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑購自Ｓｉｇｍａ公司；Ｔｒｉｚｏｌ試劑購自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ｒＴａｑ ＤＮＡ聚合酶、限制性內切酶、Ｔ４ ＤＮＡ連接酶、ＤＮＡ凝膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒購自ＴａＫａＲａ公司；ｍＲＮＡ純化試劑盒、Ｅ． ｃｏｌｉ ＴＧ１、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ、Ｍ１３ＫＯ７輔助噬菌體、ＳｃＦｖ構建試劑盒、重組噬菌體篩選試劑盒購自Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司；蛋白胨、酵母提取物購自Ｏｘｏｉｄ公司；ＴＭＢ（３，３′，５，５′－四甲基聯苯胺）由中國華美生物工程公司進口分裝；其余基本試劑均為分析純。

１．２方法

１．２．１動物免疫及ｍＲＮＡ的分離免疫原ＨＯＭ－ＢＳＡ與等量弗氏完全佐劑混合，對小鼠腹腔注射進行免疫。換不完全佐劑，隔２周加強一次，共加強５次，取小鼠脾臟前３ ｄ再用ＨＯＭ－ＢＳＡ加強免疫一次，采用酶聯免疫吸附測定（ＥＬＩＳＡ）法檢驗抗體滴度，取免疫效果好的小鼠脾臟以Ｔｒｉｚｏｌ試劑提取總ＲＮＡ，經Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）纖維素層析柱分離得ｍＲＮＡ。

１．２．２ＶＨ，ＶＬ 基因擴增以ｍＲＮＡ為模板，在鼠源反轉錄酶催化下，以隨機六聚體為引物合成ｃＤＮＡ第一鏈，用小鼠抗體重、輕鏈可變區特異性引物，ＰＣＲ擴增ＶＨ和ＶＬ基因。將ＰＣＲ產物進行１．５％瓊脂糖凝膠電泳，用ＤＮＡ凝膠回收試劑盒回收目的基因片段。

１．２．３ＳｃＦｖ基因的克隆純化回收的ＶＨ、ＶＬ基因片段與Ｌｉｎｋｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ以等摩爾濃度混合，進行重疊延伸ＰＣＲ反應。ＰＣＲ反應參數為９４℃、１ ｍｉｎ，６３℃、４ ｍｉｎ，進行７個循環后延伸５ ｍｉｎ，從而將ＶＨ、ＶＬ基因隨機拼接成ＳｃＦｖ，再繼續進行３０次循環，反應條件為９４℃、１ ｍｉｎ，５５℃、２ ｍｉｎ，７２℃、２ ｍｉｎ，循環結束后，７２℃延伸１０ ｍｉｎ。將ＰＣＲ 產物進行１．５％瓊脂糖凝膠電泳，用ＤＮＡ凝膠回收試劑盒回收目的基因片段。

１．２．４抗速滅威噬菌體ＳｃＦｖ庫的構建將純化的ＳｃＦｖ片段用ＳｆｉⅠ、ＮｏｔⅠ雙酶切，與經同種雙酶預切的ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ噬菌粒載體連接，轉化感受態

Ｅ． ｃｏｌｉ ＴＧ１，鋪板后，３０℃過夜培養，計算重組子數，估計庫容。隨機挑取文庫的重組子，提取質粒后ＰＣＲ擴增ＳｃＦｖ基因片段，電泳回收后的ＳｃＦｖ基因片段用ＢｓｔＮⅠ酶切消化，４％瓊脂糖凝膠電泳分析酶切指紋圖譜，進行文庫多樣性分析，同時對提取的質粒進行Ｈｉｎ ｄⅢ、Ｅｃｏ ＲⅠ雙酶切鑒定。其余菌落用２×ＹＴ液體培養基沖刮并收集，加入氨芐青霉素至１０５μｇ／Ｌ、葡萄糖至２％，并加入Ｍ１３ＫＯ７輔助噬菌體超感染，３７℃振蕩培養１ ｈ后，離心沉淀菌體，用２×ＹＴ－ＡＫ液體培養基懸浮，３７℃振蕩培養過夜，離心沉淀菌體細胞，上清即為抗速滅威噬菌體ＳｃＦｖ庫。

１．２．５抗速滅威噬菌體ＳｃＦｖ庫的富集篩選

１）第一輪富集篩選。參照文獻［４］的步驟進行第一輪富集篩選。在進行第一輪篩選時，降低篩選強度可避免有價值的稀有噬菌體重組子的丟失。本研究第一輪包被抗原ＨＯＭ－ＯＶＡ的濃度為５０.0 μｇ／ｍＬ，噬菌體ＳｃＦｖ的非特異性洗脫次數為１０次。篩選結束?。保?μＬ已感染重組噬菌體的細菌培養物作６次１０倍稀釋，１００ μＬ／ＳＯＢＡＧ平板，３０℃溫箱培養過夜，測定噬菌體ＳｃＦｖ滴度，計算噬菌體的回收率，分析親和富集效果。

２）后四輪富集篩選。第二、三、四、五輪篩選抗原的包被濃度依次為５．０、３．０、１．０、０．５ μｇ／ｍＬ，第二輪以后的噬菌體ＳｃＦｖ的非特異性洗脫次數為２０次，其余步驟同第一輪。

３）多克隆噬菌體ＥＬＩＳＡ。采用多克隆噬菌體ＥＬＩＳＡ分析各輪吸光度值變化可初步鑒定每輪富集篩選的效果。①將包被抗原ＨＯＭ－ＯＶＡ用０．０５ ｍｏｌ／Ｌ碳酸鹽包被緩沖液（ｐＨ值為９．６）稀釋為１０ μｇ／ｍＬ，９６孔酶標板１００ μＬ／孔包被，４℃過夜；②去包被液，ＰＢＳ緩沖液洗滌３次，３％脫脂奶粉（ＰＢＳ緩沖液配置）２００ μＬ／孔，３７℃封閉２ｈ；③去封閉液，ＰＢＳ緩沖液洗滌３次，每輪篩選后，分別取相同滴度（５×１０９ PFU／ｍＬ）、ＰＥＧ／ＮａＣｌ沉淀獲得的噬菌體ＳｃＦｖ與等體積３％的脫脂奶粉（ＰＢＳ緩沖液配置）混勻，１００ μＬ／孔，３７℃孵育２ ｈ，陰性對照為相同滴度擴建的原始噬菌體ＳｃＦｖ庫；④去噬菌體懸液，以０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ洗滌６次；酶標二抗ＨＲＰ／Ａｎｔｉ－Ｍ１３用３％脫脂奶粉（ＰＢＳ緩沖液配置）做１∶１０ ０００的稀釋，１００ μＬ／孔，３７℃孵育１ｈ；⑤棄去溶液，以０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ洗滌６次，加入ＴＭＢ顯色液１００ μＬ／孔，３７ ℃孵育１０ ｍｉｎ；⑥５０ μＬ ２ｍｏｌ／Ｌ Ｈ２ＳＯ４／孔終止反應；⑦酶聯儀測定ＯＤ４５０ｎｍ值。

４）單克隆噬菌體ＥＬＩＳＡ。隨機挑選第三、四、五輪經ＰＣＲ和酶切驗證的重組子制備單克隆噬菌體ＳｃＦｖ；取相同滴度的單克隆噬菌體ＳｃＦｖ參照上述多克隆噬菌體ＥＬＩＳＡ步驟進行檢測，陽性判定的標準為ＯＤ值大于等于陰性對照孔的２．１倍；通過計算每輪篩選的單克隆噬菌體ＳｃＦｖ的陽性率來鑒定富集篩選效率。

１．２．６高親和力高特異性抗速滅威噬菌體ＳｃＦｖ的篩選

１）單克隆噬菌體ＥＬＩＳＡ篩選試驗。①抗體庫經五輪富集篩選后，將最后一輪篩選后的涂布在ＳＯＢＡＧ平板上，分批挑選經ＰＣＲ及酶切驗證含重組噬菌粒的重組子制備單克隆噬菌體ＳｃＦｖ；②取相同滴度的噬菌體ＳｃＦｖ進行單克隆噬菌體ＥＬＩＳＡ篩選試驗，陰性對照孔為相同滴度用空載體轉化菌擴增的Ｍ１３Ｋ０７；③取ＥＬＩＳＡ吸光度值高的陽性克隆進行下一步競爭抑制試驗，陽性判定的標準為ＯＤ值大于等于陰性對照孔的２．１倍。

２）競爭抑制試驗。采用游離的速滅威原藥進行單克隆噬菌體ＥＬＩＳＡ競爭抑制試驗可進一步排除具高親和力的非特異性陽性克隆。將５０ μＬ用３％脫脂奶粉（ＰＢＳ緩沖液配置）稀釋的噬菌體抗體（５×１０１０PFU／ｍＬ）與５０ μＬ不同濃度的（１、１０、１００ μｇ／ｍＬ）速滅威原藥（用３％脫脂奶粉１０倍稀釋）３７℃孵育３０ ｍｉｎ，使抗原抗體充分反應，其余操作同上述多克隆噬菌體ＥＬＩＳＡ；計算抑制率，分析競爭抑制效果。抑制率＝（未加速滅威的ＯＤ４５０ nm－加入速滅威的ＯＤ４５０ nm）／未加速滅威的ＯＤ４５０ nm×１００％。

２結果與分析

２．１抗體基因ＰＣＲ產物的鑒定

用１．５％瓊脂糖凝膠電泳檢測ＰＣＲ產物，結果顯示擴增出的ＶＨ和ＶＬ基因片段分別約為３４０ ｂｐ和３２０ ｂｐ（圖１），重疊延伸ＰＣＲ后，獲得擴增產物約為７5０ ｂｐ的ＳｃＦｖ基因（圖２），與預期的片段大小相符。

２．２抗速滅威噬菌體ＳｃＦｖ庫的構建

ＳｃＦｖ基因片段經酶切、連接后，轉化Ｅ． ｃｏｌｉ ＴＧ１感受態細胞。重組子在氨芐青霉素選擇性培養基上生長旺盛，連接產物的載體轉化率約為４．５×１０５／μｇ載體。為了增加抗體庫容量，本研究將每４０ μＬ感受態細胞與４ μＬ連接產物混勻后電轉，共進行了４０次連接和８０次轉化反應來構建抗速滅威噬菌體ＳｃＦｖ庫。經計數，長出的重組子總數約為７．６×１０５，而以未轉化的ＴＧ１感受態細胞涂布的平板則沒有重組子長出。

２．３抗速滅威噬菌體ＳｃＦｖ庫的鑒定

２．３．１重組子的ＰＣＲ鑒定以隨機挑選的重組子的質粒為模板，均能擴增出分子量大小約７５０ ｂｐ的ＤＮＡ片段（圖３）。

２．３．２重組子的雙酶切鑒定對ＰＣＲ鑒定結果為陽性的重組噬菌粒進行Ｈｉｎ ｄⅢ、Ｅｃｏ ＲⅠ雙酶切鑒定，電泳結果顯示均被切成約２ １１１ ｂｐ和３ １１１ ｂｐ的兩個條帶（圖４），表明有外源基因插入片段，連接轉化成功。

２．３．３文庫的多樣性分析由于ＢｓｔＮⅠ的切割位點［５′－ＣＣ（Ａ／Ｔ）ＧＧ－３′］在免疫球蛋白的可變區基因中大量的存在，因此可用ＢｓｔＮ Ｉ酶切來間接鑒定文庫的多樣性［５］。本試驗從文庫中隨機挑取的重組子的ＳｃＦｖ基因片段經ＢｓｔＮ Ｉ酶切后的指紋譜型各不相同（圖略），說明文庫的多樣性好、實際有效性有保障，該抗體庫的庫容量約７．６×１０５。

２．４抗速滅威噬菌體ＳｃＦｖ庫的富集篩選

以速滅威人工抗原ＨＯＭ－ＯＶＡ對抗速滅威噬菌體ＳｃＦｖ庫進行了５輪“吸附-洗脫-擴增”的富集篩選。通過降低抗原包被濃度和增強洗脫力度的方法逐漸洗去了非特異性吸附的噬菌體ＳｃＦｖ。經測定，噬菌體第一、二、三、四、五輪的回收率分別為１．０×１０－４％、１．１×１０－５％、２．６×１０－４％、５．９×１０－４％、５．６×１０－４％，總體上顯示了一個增加的趨勢，說明特異性的噬菌體ＳｃＦｖ得到了有效富集。

２．５富集篩選效果的分析鑒定

２．５．１多克隆噬菌體ＥＬＩＳＡ的初步分析５輪洗脫液擴增的噬菌體ＳｃＦｖ各取５×１０９PFU／ｍＬ進行多克隆噬菌體ＥＬＩＳＡ檢測，其ＯＤ４５０ nm值逐輪增高，分別為第一輪０．１０７±０．０１0、第二輪０．１４３±０．０２0、第三輪０．２８２±０．０２0、第四輪０．４３１±０．０１0、第五輪０．５３３±０．０２0，而陰性對照（原庫擴增產物）ＯＤ４５０ nm值為０．０７６±０．０１０。結果顯示，從第三輪開始，ＯＤ４５０ nm值已為陰性對照的２．１倍以上，說明各輪富集篩選有效。

２．５．２重組子的ＰＣＲ鑒定經過對第三、四、五輪富集篩選后ＳＯＢＡＧ平板菌的菌落ＰＣＲ鑒定，每輪隨機挑選的２０個重組子均能擴增出大小約７５０ ｂｐ的片段（圖略），不存在插入子片段缺失的現象。

２．５．３重組子的雙酶切鑒定選ＰＣＲ鑒定結果為陽性的噬菌粒進行Ｈｉｎ ｄⅢ、Ｅｃｏ ＲⅠ雙酶切鑒定，電泳結果顯示均被切成約２ １１１ ｂｐ和３ １１１ ｂｐ兩個條帶（圖略），證明富集篩選過程中插入的ＳｃＦｖ片段沒有丟失。

２．５．４篩選效率的比較對上述第三、四、五各輪隨機挑選的２０個經ＰＣＲ和酶切鑒定的重組子進行單克隆噬菌體ＥＬＩＳＡ檢測，結果顯示，第三、四、五輪的陽性率分別為３５％、６５％、８０％，第三、四、五輪的Ｐ／Ｎ均值分別為２．３２、３．２１、４．４１，說明本試驗富集篩選效率較高。

２．６單克隆噬菌體ＥＬＩＳＡ篩選高親和力陽性克隆

從第五輪篩選后得到的細菌集落中分批隨機挑選大量重組子，以未經篩選的噬菌體初級庫為對照，單克隆噬菌體ＥＬＩＳＡ測定這些重組子的噬菌體ＳｃＦｖ與ＨＯＭ－ＯＶＡ的結合活性，從中篩選出２０個Ｐ／Ｎ值達到４．００以上的高親和力陽性克隆。

２．７陽性克隆競爭抑制試驗結果

為了排除假陽性發生，對上述２０個陽性克隆進行競爭抑制反應，競爭抑制結果顯示：當抗原包被濃度為５.0 μｇ／ｍＬ、噬菌體滴度為５×１０１０PFU／ｍＬ時，有６個陽性克隆對速滅威的識別作用明顯（表１），競爭抑制反應體系中速滅威濃度為１０ μｇ／ｍＬ時，抑制率均達到２０％以上。

３討論

抗速滅威噬菌體ＳｃＦｖ庫的多樣性是獲得特異性噬菌體ＳｃＦｖ及分泌表達單鏈抗體的關鍵所在。為了能最大限度地獲得抗體可變區基因，保持文庫的多樣性，我們采取了以下措施：①擴增小鼠重鏈、輕鏈基因時采用的ＰＣＲ引物套組是根據抗體可變區基因上、下游相對保守的骨架區設計的，理論上該套引物能結合數百個Ｖ片段中的任何一個以及６個Ｊ片段中的任何一個，有較好的通用性，可確保ＳｃＦｖ文庫能最大限度地保持小鼠體內Ｂ細胞克隆的多樣性，這是保證抗體庫容量的基礎［６］。②在試驗中加大了ＶＨ、ＶＬ的原始用量（由ｃＤＮＡ 擴增得到的ＶＨ、ＶＬ）；盡管操作手冊建議用ＰＣＲ產物再擴增，但擴增后僅僅增加了基因的量，抗體庫中基因的多樣性并沒有增加；因此研究中我們采用了混合多次、由ｃＤＮＡ直接擴增得到的ＶＨ、ＶＬ ＰＣＲ產物的方法來保證其所用量。ＢｓｔＮ Ｉ酶切指紋圖譜分析表明，本研究所構建的免疫抗體庫具有良好的多樣性分布，庫容量為７．６×１０５。

噬菌體ＳｃＦｖ庫的篩選，需要對許多條件進行優化，包括噬菌體的制備及其滴度，但更重要的是要優化篩選策略。本研究我們通過降低抗原濃度、增強洗脫力度的方法逐漸富集與之特異性高親和力高的噬菌體。①利用抗原濃度遞減的梯度式篩選。因為第一輪淘選時，陽性克隆在抗體庫中的比例和數量很低，若選擇強度過高，極易導致陽性克隆的丟失，且在后幾輪的淘選中將無法彌補。經過第一輪的淘選后，陽性克隆獲得了一次富集和擴增，數量和比例均得以大幅度提升，因此在隨后的淘選中，即使提高嚴謹度，陽性克隆也不易丟失。②確定篩選輪數。篩選輪數過少，特異性噬菌體ＳｃＦｖ不能高度富集，篩選輪數過多，產出率會降低。有研究證明，重復５次篩選效果較好［７，８］。本研究為了得到特異性高的噬菌體抗體，共經過了５輪嚴格的“吸附-洗脫-擴增”淘洗過程。③確定洗滌次數。本研究第一輪篩選洗滌１０次，可將非特異性噬菌體和輔助噬菌體洗去，第二輪以后洗滌２０次，可除去親合力低的噬菌體ＳｃＦｖ，得到高親合力的噬菌體ＳｃＦｖ。噬菌體回收率及ＥＬＩＳＡ鑒定結果顯示，上述篩選策略是較為成功的。

本研究通過５輪“吸附-洗脫-擴增”的過程，觀察到了特異性噬菌體ＳｃＦｖ的富集，但是，富集程度與國外文獻報道的相比有一定的差距，篩選出的陽性克隆比例亦低于文獻報道［９］。分析原因可能為：用單一純化抗原免疫小鼠構建的文庫通用性差、容量偏小，Ｂ細胞中原始的重輕鏈之間的組配（Ｐａｉｒｉｎｇ）可能發生了丟失。理論研究表明文庫容量越大篩選任意抗原表位的抗體的機率就越大，發現高親合力噬菌體ＳｃＦｖ的可能性也會有所增加［１０－１２］。誠然，經過一系列的篩選雖然獲得了６個有一定特異性的噬菌體ＳｃＦｖ，但我們應該看到這些陽性克隆的親和活性僅僅是分泌型噬菌體ＳｃＦｖ所表現的活性，而且，噬菌體外殼蛋白對ＳｃＦｖ的活性還存在一定的影響，因此，關于這些陽性克隆的應用前景仍有待于對可溶性ＳｃＦｖ特性的進一步研究加以驗證。

４結論

本研究以速滅威抗原免疫的小鼠為試驗對象，成功構建了庫容約７．６×１０５的抗速滅威噬菌體ＳｃＦｖ庫，通過對該文庫的５輪“吸附-洗脫-擴增”的富集篩選，獲得了６個特異性較強的抗速滅威噬菌體ＳｃＦｖ陽性克隆。本研究結果為速滅威特異性抗體的大量制備奠定了一定的基礎，對開發其他化學農藥的重組抗體具有重要的理論價值和實踐意義。

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［９］ ＳＨＥＮＬＡＮ Ｍ， ＣＨＡＮＧＳＨＯＵ Ｇ， ＣＨＩＨ－ＨＵＮＧ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｐｈａｇｅ－ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｈｕｍａｎ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｓｉａｌｙｌ Ｌｅｗｉｓｘ ａｎｄ Ｌｅｗｉｓｘ［Ｊ］． Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １９９９， ９６（１２）：６９５３－６９５８．

［１０］ ＤＥ ＨＡＡＲＤ Ｈ Ｊ，ＶＡＮ ＮＥＥＲ Ｎ，ＲＥＵＲＳ Ａ，ｅｔ ａｌ． Ａ ｌａｒｇｅ ｎｏｎ－ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｈｕｍａｎ ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｐｈａｇｅ ｌｉｂｒａｒｙ ｔｈａｔ ｐｅｒｍｉｔｓ ｒａｐｉｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｋｉｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ［Ｊ］． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９９，２７４：１８２１８－１８２３０．

［１１］ ＶＡＵＧＨＡＮ Ｔ Ｊ，ＷＩＬＬＩＡＭＳ Ａ Ｊ，ＰＲＩＴＣＨＡＲＤ Ｋ，ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｓｕｂｎａｎｏｍｏｌａｒ ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｌａｒｇｅ ｎｏｎ－ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ［Ｊ］． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９６，１４：３０９－３１４．

［１２］ ＳＨＥＥＴＳ Ｍ Ｄ，ＡＭＥＲＳＤＯＲＦＥＲ Ｐ，ＦＩＮＮＥＲＮ Ｒ，ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｌａｒｇｅ ｎｏｎｉｍｍｕｎｅ ｐｈａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ：Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｈｕｍａｎ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｔｉｇｅｎｓ［Ｊ］． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８，９５（１１）：６１５７－６１６２．