利用RT-PCR技術檢測吊瓜病毒種類的研究

摘要：小西葫蘆黃花葉病毒（Ｚｕｃｃｈｉｎｉ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ，ＺＹＭＶ）、西瓜花葉病毒（Ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ，ＷＭＶ）、黃瓜花葉病毒（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ，ＣＭＶ）、南瓜花葉病毒（Ｓｑｕａｓｈ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ，ＳｑＭＶ）和番木瓜環斑病毒（Ｐａｐａｙａ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ，ＰＲＳＶ）是危害葫蘆科作物最嚴重、最廣泛的５種病毒。根據已知的５種病毒序列設計特異性引物，對感染病毒的吊瓜總ＲＮＡ進行ＲＴ－ＰＣＲ擴增。結果表明長興吊瓜的病毒種類主要為ＰＲＳＶ，感染率為１００％，無復合病毒感染。吊瓜植株不同取樣部位（莖尖、卷須、嫩葉、莖、花、子房、老葉等）的ＲＴ－ＰＣＲ表明老葉是較好的病毒檢測取樣部位，而嫩葉是吊瓜脫毒最佳的外植體取樣部位。對莖尖的ＰＲＳＶ表達量高過幼葉的原因也進行了分析，認為可能是病毒的表達量與植株的代謝強度有關。

關鍵詞：吊瓜；ＲＴ－ＰＣＲ；病毒檢測；病毒分布

中圖分類號：Ｓ６４２ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）09－1904-04

Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｉｎ Ｃａｕｓａｌ Ｖｉｒｕｓｅｓ in Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ ｋｉｒｉｌｏｗｉｉ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ

ＸＵ Ｊｉｎｇ，ＷＡＮＧ Ｚｈｅｎ－ｈｕａ，ＰＡＮＧ Ｊｉ－ｌｉａｎｇ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００３６，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｚｕｃｃｈｉｎｉ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（ＺＹＭＶ）， Ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（ＷＭＶ）， Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ （ＣＭＶ）， Ｓｑｕａｓｈ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ （ＳｑＭＶ） ａｎｄ Ｐａｐａｙａ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ （ＰＲＳＶ） ａｒｅ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｓｅｒｉｏｕｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅｏｕｓ ｃｒｏｐｓ． Ｆｉｖｅ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ５ ｖｉｒｕｓｅｓ， ａｎｄ ＲＴ－ＰＣＲ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ ｋｉｒｉｌｏｗｉｉ Ｍａｘｉｍ． ｌｅａｖｅｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｖｉｒｕｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃａｕｓａｌ ｖｉｒｕｓ ｏｆ Ｔ． ｋｉｒｉｌｏｗｉｉ ｉｎ Ｃｈａｎｇｘｉｎｇ ｗａｓ ＰＲＳＶ ｗｉｔｈ １００％ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｒａｔｅ ａｓ ｎｏ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ． Ｔｈｅ ＲＴ－ＰＣＲ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓａｍｐｌｉｎｇ ｐａｒｔｓ ｏｆ Ｔ． ｋｉｒｉｌｏｗｉｉ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｐａｒｔ ｆｏｒ ｖｉｒｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｏｌｄ ｌｅａｖｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｓｔｖｉｒｕｓ－ｆｒｅｅ ｐａｒｔ ｗａｓ ｙｏｕｎｇ ｌｅａｖｅ． Ｔｈｅ ｃａｕｓｅ ｏｆ ｍｏｒｅ ＰＲＳＶ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｓｈｏｏｔ ｔｉｐ ｔｈａｎ ｉｎ ｙｏｕｎｇ ｌｅａｖｅｓ ｗａｓ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ， ａｎｄ ｉｔ ｗａｓ ｐｏｓｓｉｂｌｙ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｓ ｗａｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｐｌａｎｔ＇ｓ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ ｋｉｒｉｌｏｗｉｉ Maxim.； ＲＴ－ＰＣＲ；ｖｉｒｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ； ｖｉｒｕｓ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ

吊瓜，學名栝樓（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ ｋｉｒｉｌｏｗｉｉ Ｍａｘｉm．），屬葫蘆科多年生蔓性藤本植物。其根、莖、葉、瓜皮、種子均可供藥用，富含三萜皂甙、有機酸、樹脂、糖類、色素、蛋白質、脂肪油等，有解熱止渴、利尿、鎮咳祛痰等功效，并具抗腫瘤的作用。近年來，隨著吊瓜開發和研究的不斷深入，吊瓜子也已成為炒貨中的佳品，它濃香撲鼻，深受消費者喜愛，市場前景極為廣闊。吊瓜通常以種子或扦插繁殖，種子繁殖由于混交嚴重，種質退化迅速；扦插繁殖時由于病毒病積累，導致大量減產。如何獲得優質不帶病毒的吊瓜種苗已是吊瓜生產上迫切需要解決的問題。因此，亟需建立一種合適的吊瓜病毒檢測方法。

目前，植物病毒的檢測方法主要有生物學、電鏡觀察、血清學、ＲＴ－ＰＣＲ和核酸雜交等［１］，但由于生物學檢測法周期長，電鏡操作需要一定技能，儀器費用高，也不易進行大量樣本的集中處理，所以生物學方法和電鏡檢測在病毒檢測中存在很大局限性。血清學方法的應用相對較為廣泛［２，３］，但商品化的抗血清價格較高，靈敏度不夠高，易出現非特異性反應，檢測結果不可靠。而ＲＴ－ＰＣＲ技術具有簡便、快速、靈敏度高、特異性強等顯著優點，在植物病毒檢測中得到了廣泛的應用［４－６］。危害葫蘆科作物的病毒多達４８種［７］，而且在田間病毒經常還會發生復合感染，目前尚無吊瓜病毒檢測相關文獻報道，本研究選取了發生普遍、危害嚴重的ＺＹＭＶ、ＷＭＶ、ＣＭＶ、ＳｑＭＶ、ＰＲＳＶ ５種病毒對采集的田間吊瓜染病樣本進行ＲＴ－ＰＣＲ檢測，為吊瓜病毒病的防治及抗病育種工作提供了理論依據。

１材料和方法

１．１材料

感染病毒的吊瓜植株來自浙江省長興縣，引種后栽種于杭州師范大學溫室。

１．２試劑

Ｔｒｉｚｏｌ試劑購自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；反轉錄試劑盒購自東洋紡（上海）生物科技有限公司；Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶購自廣州東盛生物科技有限公司。

１．３總ＲＮＡ的提取

取０．２～０．５ ｇ感染病毒的新鮮吊瓜葉片置于處理過的研缽中，加液氮研磨成粉末后迅速轉移至１．５ ｍＬ的Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，用Ｔｒｉｚｏｌ試劑提取總ＲＮＡ，最后用２０ μＬ ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏ溶解總ＲＮＡ。

１．４引物的設計和合成

根據ＧｅｎＢａｎｋ上登錄的各病毒序列，用Ｐｒｉｍｅｒ５軟件設計各病毒的特異性引物。引物設計完成后，通過ＮＣＢＩ對其特異性進行分析，均具有良好的特異性。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，見表１。

１．５ｃＤＮＡ合成和ＰＣＲ擴增

用反轉錄試劑盒合成各病毒ｃＤＮＡ第一鏈。ＰＣＲ反應在５０ μＬ體系中進行：３６．５ μＬ ｄｄＨ２Ｏ、５．０ μＬ １０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、４．０ μＬ 10 μｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰs、１．０ μＬ 病毒正向引物（１０ μｍｏｌ／Ｌ）、１．０ μＬ病毒反向引物（１０ μｍｏｌ／Ｌ）、２．０ μＬ ｃＤＮＡ模板和０．５ μＬ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶，ＰＣＲ反應程序：９４ ℃預變性５ ｍｉｎ；９４ ℃變性３０ ｓ、５５ ℃退火３０ ｓ、７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，循環３０次；最后７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ產物經１．０％瓊脂糖凝膠電泳后分析比較。

１．６ＰＣＲ產物測序

將ＲＴ－ＰＣＲ產物回收純化后與ｐＭＤ１８－Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ連接轉化大腸桿菌ＤＨ５α感受態細胞，用氨芐青霉素和β－半乳糖苷酶的底物Ｘ－Ｇａｌ進行藍白斑篩選。陽性克隆經ＰＣＲ和限制性酶酶切分析進一步篩選后，提取質粒送上海澤衡生物技術有限公司測序，利用ＤＮＡＭＡＮ和ＢＬＡＳＴ對所測序列進行比較分析。

２結果與分析

２．１染病吊瓜樣品與健康吊瓜樣品的癥狀

調查發現，浙江長興吊瓜普遍受病毒侵染，且病毒病后期常導致大量減產，這嚴重影響了吊瓜產業的發展。染病的吊瓜植株癥狀主要為花葉、出現小黃斑、葉片黃化，后期黃化壞死（圖１－Ａ）；而組培苗也有黃化、出現小黃斑的癥狀，這說明組培苗還未脫除母株體內的病毒（圖１－Ｂ）。未受病毒侵染的健康吊瓜植株葉片深綠，無黃斑、花葉、黃化現象（圖１－Ｃ）。

２．２５種病毒ＲＴ－ＰＣＲ擴增結果

以ＺＹＭＶ、ＷＭＶ、ＣＭＶ、ＳｑＭＶ和ＰＲＳＶ ５種病毒的反轉錄產物為ＰＣＲ反應的模板，經ＰＣＲ擴增后ＺＹＭＶ、ＷＭＶ、ＣＭＶ、ＳｑＭＶ均未得到相應的條帶，僅ＰＲＳＶ得到１條大小５７０ ｂｐ左右的特異性條帶（圖２），這與按ＰＲＳＶ外殼蛋白基因序列設計的引物目標片段大小相符，說明擴增的條帶可能是從ＰＲＳＶ病毒基因組特異擴增得來的，健康陰性對照則無任何擴增條帶出現。在１０塊不同田地的材料中全部檢測到ＰＲＳＶ，檢出率達到１００％。

２．３ＲＴ－ＰＣＲ檢測靈敏度

將受病毒侵染的吊瓜葉片總ＲＮＡ按３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６倍梯度稀釋為不同濃度后的擴增結果表明，ＲＴ－ＰＣＲ在ＰＲＳＶ病毒ＲＮＡ稀釋３５倍時仍能夠獲得陽性結果（圖３），這說明ＲＴ－ＰＣＲ對病毒檢測具有較高的靈敏度。

２．４ＲＴ－ＰＣＲ對吊瓜不同取樣部位的ＰＲＳＶ檢測

用同一感病植株的莖尖（５ ｍｍ）、幼嫩卷須、橫向直徑１０ ｍｍ以下的嫩葉、橫向直徑１０～２０ ｍｍ的嫩葉、嫩莖、老莖、花萼、花瓣、子房、老葉提取ＲＮＡ，分別進行ＲＴ－ＰＣＲ，結果均得到了清晰的擴增條帶（圖４）。結果表明，病毒ＰＲＳＶ在以上吊瓜組織中均有分布，且不同取樣部位的特異擴增條帶的強度不同，ＰＲＳＶ在幼嫩卷須、老莖、花萼、花瓣、子房、老葉中擴增較強；在莖尖（５ ｍｍ）、嫩莖處稍弱；在橫向直徑１０ ｍｍ以下與橫向直徑１０～２０ ｍｍ的嫩葉處最弱。

２．５ＰＣＲ產物序列分析

ＰＲＳＶ的ＲＴ－ＰＣＲ擴增產物經純化后測序。測序結果表明ＰＲＳＶ的擴增產物序列由５７０個核苷酸組成，與設計的ＰＣＲ產物大小相同。序列同源性分析結果表明，所得序列與參考序列的同源率達到９９％，為ＰＲＳＶ基因的部分序列，這進一步證明了ＲＴ－ＰＣＲ檢測結果的可靠性。

２．６ＲＴ－ＰＣＲ對吊瓜組培苗的檢測

應用ＲＴ－ＰＣＲ隨機抽樣檢測以莖尖為外植體的吊瓜組培苗４株，結果都檢測到未脫除的ＰＲＳＶ（圖５）。證明該方法具有較高的準確性，可以用于大量脫毒苗的檢測。

３結論

ＲＴ－ＰＣＲ技術用于植物病毒的檢測具有特異性強、靈敏度高、快速簡便及所需樣品量少等特點，因而對于病毒侵染早期及種子帶毒的檢測具有重要意義，可以為許多植物病毒的檢測所借鑒。

本文對來自１０份不同田地的吊瓜染病樣本進行了ＲＴ－ＰＣＲ檢測，結果從感病組織中全部擴增出與ＰＲＳＶ預期大小一致的目的片段，而健康組織無此擴增產物，說明擴增片段是從ＰＲＳＶ病毒基因組特異擴增得來的，目的片段的序列測定進一步證明了這一點；至于另外４種病毒，ＲＴ－ＰＣＲ均未擴增出任何條帶，這說明侵染吊瓜的病毒種類可能為ＰＲＳＶ單一感染。本實驗只選取了危害最普遍的５種病毒進行檢測，至于有沒有這５種病毒以外的其他病毒復合感染，這需要進一步對吊瓜染病癥狀進行觀察研究。

為了了解病毒ＰＲＳＶ在宿主體內的分布狀況，本實驗對吊瓜的不同部位——莖尖（５ ｍｍ）、幼嫩卷須、橫向直徑１０ ｍｍ以下的嫩葉、橫向直徑１０～２０ ｍｍ的嫩葉、嫩莖、老莖、花萼、花瓣、子房、老葉的病毒分布進行了檢測，這不僅對于尋找合適的外植體部位來對吊瓜進行脫毒處理，進而獲得脫毒苗具有重大意義；另外，由于病毒在感病植株體內各組織器官具有不均勻分布特性［８］，這也有效避免了因檢測部位差異造成的檢測結論偏差。莖尖很少受病毒侵染，所以人們常取莖尖經組培獲得脫毒苗。然而在提取ＲＮＡ濃度基本相同的條件下，本實驗結果卻顯示莖尖的病毒表達量高過嫩葉，這可能預示ＰＲＳＶ的表達與植株的代謝強度有關。因為嫩葉代謝強度較莖尖弱，所以其病毒的表達量也相對較低。

本實驗建立的吊瓜病毒ＲＴ－ＰＣＲ檢測方法，在吊瓜栽培生產中，能夠快速、準確、簡便、經濟地檢測出幼苗帶毒情況，對預防和控制病害在田間的發生、減少經濟損失、抗病篩選和病害流行預測具有十分重要的意義。

參考文獻：

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