鹽脅迫對小麥幼苗POD活性和同工酶的影響

2011-12-31 00:00:00宋旸裴冬麗

湖北農業科學 2011年9期

摘要：研究了０．４ｍｏｌ／Ｌ氯化鈉（ＮａＣｌ）處理后４個河南廣泛種植的小麥品種幼苗根和葉中過氧化物酶（ＰＯＤ）活性及其同工酶酶譜的變化情況。結果表明，４個小麥品種在鹽脅迫處理后，根和葉中的ＰＯＤ活性均有不同程度的增強，且無論是對照還是鹽脅迫處理，根中的ＰＯＤ活性都要高于其葉中的ＰＯＤ活性。ＰＯＤ同工酶酶譜在不同小麥品種間的不同組織中存在差異性，根中的ＰＯＤ同工酶酶帶總體染色比葉中深；經鹽脅迫處理后，根和葉中的酶帶顏色均有不同程度的加深。

關鍵詞：鹽脅迫；小麥；ＰＯＤ活性；同工酶

中圖分類號：Ｓ５１２．１．０１；Ｑ９４５．７８；Ｑ５５４＋．６文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）09－1759-03

Effect of Salt Stress on Peroxidase and Isoenzyme in Wheat Seedlings

ＳＯＮＧＹａｎｇ，ＰＥＩＤｏｎｇ－ｌｉ

（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＳｈａｎｇｑｉｕＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｑｉｕ４７６０００，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｃｈａｎｇｅｏｆｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＰＯＤ）ｉｓｏｅｎｚｙｍｅｚｙｍｏｇｒａｍａｎｄａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＰＯＤｉｎｔｈｅｒｏｏｔｓａｎｄｌｅａｖｅｓｏｆｓｅｅｄｌｉｎｇｓｏｆｆｏｕｒｗｈｅａｔｖａｒｉｅｔｉｅｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ０．４ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ was studied．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｚｙｍｏｇｒａｍｏｆＰＯＤｉｓｏｅｎｚｙｍｅｗａｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｏｆｅａｃｈｗｈｅａｔｖａｒｉｅｔｉｅｓ．Ｔｈｅｚｙｍｏｇｒａｍｓｈｏｗｅｄｄｅｅｐｅｒｓｔａｉｎｉｎｇｉｎｒｏｏｔｓｔｈａｎｔｈａｔｉｎｔｈｅｌｅａｖｅｓ．Ａｆｔｅｒｓａｌｔｓｔｒｅｓｓ，ｓｏｍｅｚｙｍｏｇｒａｍｂａｎｄｓｂｅｃａｍｅ deeper ｂｏｔｈｉｎｗｈｅａｔｒｏｏｔｓａｎｄｌｅａｖｅｓ，indicating that sａｌｔ－ｓｔｒｅｓｓｃｏｕｌｄｅｎｈａｎｃｅｔｈｅＰＯＤａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｒｏｏｔｓａｎｄｌｅａｖｅｓ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ＰＯＤａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｔｈｅｒｏｏｔｓｗａｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｔｈｅｌｅａｖｅｓ， both ｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ and ｔｈｅｓａｌｔ－ｓｔｒｅｓｓｇｒｏｕｐ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｓａｌｔｓｔｒｅｓｓ；ｗｈｅａｔ；ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ； iｓｏｅｎｚｙｍｅ

同工酶（Ｉｓｏｚｙｍｅ，Ｉｓｏｅｎｚｙｍｅ）廣義是指生物體內催化相同反應而分子結構及理化性質不同的酶，幾乎存在于所有生物體中［１］。同工酶作為一類蛋白質，廣泛存在于生物的同一種屬，同一個體的不同組織，同一組織或同一細胞中。同工酶具有多態性，同一種內的不同種個體，甚至同一個體的不同部位、不同發育時期，其同工酶都有差異［２］。同工酶技術是生物化學和分子生物學不斷發展的產物，在遺傳育種、生理學、病理學、系統分類學等學科都有廣泛的應用［３］。

過氧化物酶（ＰＯＤ）及其同工酶作為植物細胞內重要的組成成分，其主要功能為：參與活性氧代謝過程；參與木質素和木栓質的合成；參與生長素的降解；參與許多物質如谷胱甘肽、草酰乙酸、氫醌、酪氨酸、阿魏酸等酚類化合物的氧化；參與環境脅迫［４］。ＰＯＤ活性的高低可以反映植物生長發育及內在代謝情況，同時也是植物抗性好壞的標志之一［５］。

近年來，鹽脅迫環境下植物基因表達的研究日益受到重視［６］。鹽脅迫是一種常見的逆境脅迫，土壤鹽漬化是世界糧食生產的大害，是限制農作物生產和產量的重要因素之一。全世界大約有占全部土地面積２５％的土壤鹽漬化，次生鹽漬化土壤面積也在不斷擴大［７，８］。近些年發現，抗鹽性的決定因素普遍存在于各種植物中，植物對鹽脅迫的反應是一個復雜的生理過程［９］。高鹽脅迫加劇植物體活性基團的產生，過量的活性物質會誘發膜脂質過氧化，造成植物體氧化性損傷，破壞膜結構，并使線粒體破損，液泡增大［１０］。

豫東平原作為河南省重要的農產區，鹽脅迫在當地分布較為普遍，對當地的小麥生產有著重要的影響［１１］。本試驗以河南省廣泛種植的４個小麥品種為材料，研究在０．４ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ脅迫處理下［１２］，各小麥品種在脅迫前后ＰＯＤ活性及同工酶酶譜的變化情況，旨在探究其變化規律，以期為篩選出具有較強抗鹽性的小麥品種提供生化依據，為小麥抗鹽基因的篩選與克隆提供參考。

１材料與方法

１．１材料

選用河南省廣泛種植的具有代表性的４個小麥品種，分別是新麥１８、煙輻１８８、周麥１８、濮麥９號。

１．２方法

１．２．１材料的處理在４個小麥品種中各選取５０粒成熟飽滿的種子，用１ g/L的氯化汞（ＨｇＣｌ２）溶液消毒處理１０ｍｉｎ，流水沖洗１０ｍｉｎ，２５ ℃催芽２４ｈ后，將萌發一致的種子播種于裝有石英砂的花盆中，置于溫室中培養，晝溫（２８±２）℃，夜溫（２０±２）℃，相對濕度８０％。每天澆灌１／２Ｈａｏｇｌａｎｄ營養液，幼苗生長至一葉一心期（約１０ｄ）時用０．４ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ溶液澆灌，持續處理３ｄ，以不含ＮａＣｌ溶液澆灌為對照。每處理進行３次重復。鹽脅迫處理３ｄ后取樣，測定ＰＯＤ的活性并分析其同工酶酶譜變化情況。

１．２．２ＰＯＤ活性測定各稱取小麥幼苗的根和葉０．５ｇ，加入２ｍＬ５０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＰＢＳ液（ｐＨ值７．８，內含０．１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ和１％ＰＶＰ），冰浴研磨至勻漿，再加入ＰＢＳ液沖洗２～３次，使最終體積為

５ｍＬ，勻漿液于４ ℃下１００００ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，取出上清液，即為酶提取液，用于ＰＯＤ活性測定和ＰＯＤ同工酶電泳。

酶活性的測定反應混合液為：０．０５ｍｏｌ／Ｌ磷酸緩沖液５０ｍＬ（ｐＨ值７．８），３０％Ｈ２Ｏ２０．０２８ｍＬ，０．２％愈創木酚０．０１９ｍＬ。取３ｍＬ反應混合液，加入０．１ｍＬ酶液，于２５ ℃條件下反應３ｍｉｎ。在４７０ｎｍ下讀數，每隔１ｍｉｎ讀取１次，共記錄４次數據，取平均值；以每分鐘ＯＤ470變化０．０１為１個ＰＯＤ活性單位。計算公式如下［１３］：酶活性＝ΔＯＤ470×Ｄ／０．０１×ＦＷ×ｔ。ΔＯＤ470為反應時間內吸光度的變化值；ＦＷ為植物鮮重（ｇ）；ｔ為反應時間（１ｍｉｎ），Ｄ為稀釋倍數，酶活單位為Ｕ／（ｇ·ｍｉｎ）。

１．２．３ＰＯＤ同工酶電泳ＰＯＤ同工酶電泳采用北京六一垂直板電泳槽進行。分離膠濃度１０％，濃縮膠濃度４％。在濃縮膠中穩定電壓為９０Ｖ，進入分離膠后穩定電壓為２００Ｖ，３～４ｈ完成電泳。同工酶電泳的染色參照醋酸－聯苯胺法染色［１４］。將顯色后的膠板浸入水中，次日用數碼相機拍照，進行分析。

２結果與分析

２．１鹽脅迫對小麥幼苗ＰＯＤ活性的影響

由圖１可知，鹽脅迫處理后，４個小麥品種的幼苗根和葉中的ＰＯＤ活性均高于對照的小麥幼苗根和葉片中的ＰＯＤ活性；表明４個小麥品種的根部或葉片在經過了高濃度的鹽脅迫處理后，ＰＯＤ活性都有不同程度的增強。由圖１還可發現，不論是鹽脅迫處理還是對照的各品種小麥，幼苗根部的ＰＯＤ活性均高于葉中的ＰＯＤ活性。

２．２鹽脅迫對小麥幼苗ＰＯＤ同工酶的影響

鹽脅迫后，４種小麥幼苗的ＰＯＤ同工酶酶譜見圖２。由圖２可知，ＰＯＤ同工酶酶譜在不同小麥品種間的不同組織中存在差異性，根中的ＰＯＤ同工酶酶帶總體染色比葉中的深。根據酶帶的集中程度和遷移率的大小，可將酶帶分為Ａ、Ｂ、Ｃ等３個區。Ａ區有１條主帶，Ｂ區有２條主帶，Ｃ區有２條主帶；其中Ｂ區、Ｃ區的條帶染色較深屬于強帶，Ａ區的條帶染色較淺屬于弱帶。與對照相比，鹽脅迫處理后，各品種小麥幼苗根和葉中的ＰＯＤ同工酶酶帶均有不同程度增強；煙輻１８８經鹽脅迫處理后，根較對照根的ＰＯＤ同工酶的條帶數及著色程度均顯著增加；濮麥９號經鹽脅迫處理后，葉較對照葉的ＰＯＤ同工酶的條帶數及著色程度也明顯增加。

３討論

植物體內各細胞、組織、器官的基因組成完全一致，但基因的表達存在時間、空間上的差異。同工酶是基因表達的產物，它是生物體為適應細胞代謝的多方面要求而形成的。在生長發育過程中，受到鹽脅迫時，植物會從代謝的不同層次和水平上作出相應的應答，在遺傳上則表現為基因表達的改變。鹽脅迫時，在細胞內代謝產物的誘導或阻遏作用下，誘導有關基因的表達而相應地關閉某些基因，以適應鹽脅迫下細胞內的特殊代謝反應。本研究發現，鹽脅迫后４個小麥品種幼苗根部和葉中部分酶帶明顯增加，表明了鹽脅迫下ＰＯＤ同工酶基因表達發生了明顯的變化，誘導產生了新的同工酶，這可能是植物體通過控制基因的轉錄、翻譯影響表達，從而達到植物體對逆境的抵抗作用，提高植物的抗逆性。

幼苗階段是植物對外界逆境較為敏感的時期，也是植物一生最關鍵的時期，直接影響植物的形態建成和果實產量。植物在逆境脅迫，如鹽脅迫下會產生大量的活性氧，包括羥自由基、超氧陰離子和Ｈ2Ｏ2等，會對細胞造成損傷，如氧化性很強的羥自由基會引發或加劇膜脂質過氧化產生丙二醛（ＭＤＡ），從而造成細胞膜系統損傷，使膜透性增高。因此，植物體會應激地產生有效的保護酶系統和自由基清除劑，以清除這些有毒物質。一般認為ＰＯＤ、超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）和過氧化氫酶（ＣＡＴ）是植物酶促反應體系的保護酶，它們協同作用，防御活性氧對細胞造成傷害，抑制膜脂質過氧化，以減輕逆境對植物體的傷害［１５］。賀巖等［１６］研究了不同基因型小麥對鹽脅迫的不同反應機制，結果表明，鹽脅迫嚴重抑制了小麥植株生長，降低了種子的萌發率，且鹽脅迫后，ＰＯＤ活性增加，由脂質過氧化所形成的ＭＤＡ積累緩慢，細胞膜受到的損傷較小，并推測ＰＯＤ可能是耐鹽小麥體內清除活性氧自由基的一種重要的保護酶。本研究結果表明，經０．４ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ處理后，通過ＰＯＤ活性檢測分析，４種小麥幼苗的根和葉中ＰＯＤ活性顯著增加；通過ＰＯＤ同工酶電泳分析，４個小麥品種幼苗處理后的酶帶數目和著色程度有不同程度增加。本試驗的研究結果進一步證實了ＰＯＤ可能在小麥耐鹽機制中參與一定的生理功能，研究其機理為進一步提高小麥的抗鹽性，篩選小麥抗鹽品系有一定意義。本研究只是從ＰＯＤ一個指標來看，植物的抗鹽機理是十分復雜的，還應參考ＳＯＤ、ＣＡＴ等其他方面的數據。

參考文獻：

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