抗萊克多巴胺多克隆抗體的制備

摘要：為了制備抗萊克多巴胺多克隆抗體，試驗通過連接劑ｂｕｔａｎｅ－１，４－ｄｉｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｙｄｙｌ ｅｔｈｅｒ把萊克多巴胺和載體蛋白ＢＳＡ和ＯＶＡ偶聯成免疫抗原和包被抗原，免疫新西蘭大白兔，飽和硫銨沉淀方法純化抗體，間接ＥＬＩＳＡ法檢測抗血清效價。結果通過免疫兔獲得了抗萊克多巴胺的多克隆抗體。經ＥＬＩＳＡ測定，其效價為１∶１２ ８００。

關鍵詞：萊克多巴胺；多克隆抗體；ＥＬＩＳＡ

中圖分類號：Ｓ８５９．８４ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）09－1836-02

Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒａｃｔｏｐａｍｉｎｅ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ

ＺHANG Ｈｏｎｇ－ｌｉｎ１，ＣHEN Ｃｈａｎｇ－ｙｕｎ１，ＺHOU Ｈｏｎｇ－ｘｉａ１，ＹU Ｘｉａｏ－ｌｉａｎ１，ＹANG Ｊｉａｎ－ｂｏ２，ＳHI Ｇｕｏ－ｑｉｎｇ２

（１． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｘｉａｏｚｈｕａｎｇ University，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１１７１，China；

２． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ， Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ， Ｓｈｉｈｅｚｉ ８３２０００，Ｘｉｎｊｉａｎｇ，China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ＲＣＴ （Ｒａｃｔｏｐａｍｉｎｅ） ｗａｓ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ＢＳＡ ａｎｄ ＯＶＡ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ ａｎｄ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ａｇｅｎｔ ｂｕｔａｎｅ－１， ４－ｄｉｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｙｄｙｌ ether， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎing Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ｒａｂｂｉｔｓ ｗｉｔｈ ＢＳＡ－ＲＣＴ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｓａｔｕｒａｔｅｄ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｉｔｓ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ｔｉｔｅｒ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ pｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ＲＣＴ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｒａｂｂｉｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｉｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ｗａｓ １∶１２ ８００．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｒａｃｔｏｐａｍｉｎｅ； ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ； ＥＬＩＳＡ

萊克多巴胺（Ｒａｃｔｏｐａｍｉｎｅ，ＲＣＴ）是苯酚胺類β２腎上腺素激動劑，具有β２興奮劑的所有功效［１－４］，其對人體危害性很大。隨著克倫特羅等一類β２興奮劑被世界各國禁止作為飼料添加劑使用［5，6］，萊克多巴胺的非法濫用日趨嚴重。ＲＣＴ可顯著提高肥育豬的生產性能，改善飼料利用效率，顯著提高豬的瘦肉率，在豬體內代謝較克倫特羅迅速而更加不易檢測［7，8］。目前，歐盟和我國禁止將萊克多巴胺作為飼料添加劑使用。因此，建立快速、有效的檢測方法迫在眉睫。酶聯免疫吸附檢測法（ＥＬＩＳＡ）是一種快速檢測方法，不需要復雜的儀器設備，靈敏度高，特異性強，樣品前處理簡單，非常適合大量樣品的檢測，便于現場監控［９］。ＥＬＩＳＡ檢測萊克多巴胺殘留國外已有報道［6，９］，且已經有萊克多巴胺殘留檢測的ＥＬＩＳＡ商品化試劑盒問世。國內已有建立ＥＬＩＳＡ方法檢測研究報道，但沒有形成商品化的試劑盒［１０］。目前我國使用的試劑盒主要是從國外進口，價格昂貴，不利于推廣使用。本試驗通過連接劑ｂｕｔａｎｅ－１，４－ｄｉｏｌｄｉｇｌｙｃｉｙｄｙｌ ｅｔｈｅｒ把萊克多巴胺和載體蛋白ＢＳＡ和ＯＶＡ偶聯成免疫抗原和包被抗原，然后制備抗ＲＣＴ的多克隆抗體，為萊克多巴胺的免疫檢測奠定基礎。

１材料

１．１試劑

鹽酸萊克多巴胺（純度９７．２％，南京師范大學惠贈）； ｂｕｔａｎｅ－１，４－ｄｉｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｙｄｙｌ ｅｔｈｅｒ；酶標山羊抗兔ＩｇＧ－ＨＲＰ （武漢博士德公司）。

１．２試驗動物

雄性新西蘭大白兔，體重１．５ｋｇ，購自南京某實驗動物中心。

１．３主要儀器

酶標儀、自動洗板機（美國Ｂｉｏ－Ｒａｄ）；高速冷凍離心機（美國Ｔｈｅｒｍｏ）；電泳儀（北京六一儀器廠）。

２試驗方法

２．１抗原制備

采用文獻［１０］介紹的方法先將ＲＣＴ·ＨＣｌ轉變成半琥珀酸酯，再用混合酸酐法分別與ＢＳＡ和ＯＶＡ偶聯制備免疫抗原（ＢＳＡ－ＲＣＴ）和包被抗原（ＯＶＡ－ＲＣＴ）。

２．２抗體的制備

取３只體重約１．５ ｋｇ的健康大耳兔，在動物房觀察飼養一周。將２ ｍＬ免疫原（ＲＣＴ－ＢＳＡ，１ ｍｇ／ｍＬ）與等量的弗氏完全佐劑用注射器對抽法按體積比１∶１混合成油包水乳濁液，混合并充分乳化。首免每只兔接種０．２５ ｍｇ免疫原，背部皮下多點注射。以后換用弗氏不完全佐劑，劑量、方法同首免，每隔兩周加強免疫一次；從第三次免疫后開始，每次免疫后７ ｄ左右，用１ ｍＬ無菌注射器從耳邊緣靜脈取血０．５ ｍＬ左右，用間接ＥＬＩＳＡ法測定血清效價。當血清效價不再增加時，心臟采血２０ ｍＬ，３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ，分離血清，用以檢測抗體效價，－２０℃儲存備用。

２．３抗ＲＣＴ多克隆抗體的鑒定

２．３．１最佳包被濃度的確定將ＢＳＡ－ＲＣＴ梯度稀釋為２００、１００、５０、１０、５ μｇ／ｍＬ，按每孔１００ μＬ包被酶標板，４℃包被過夜，自動洗板機洗滌；封閉，３７℃ ３０ ｍｉｎ；洗滌，加入１∶２００稀釋的抗血清，３７℃反應

１ ｈ；洗滌，加入１００ μＬ酶標羊抗兔抗體，３７℃反應

１ ｈ；洗滌，加１００ μＬ ＴＭＢ底物液，３７℃避光反應２０ ｍｉｎ；加５０ μＬ ２ mol/L Ｈ２ＳＯ４終止反應，用酶標儀檢測ＯＤ４５０值。取ＯＤ４５０值為１．０左右時的包被濃度為最佳濃度。

２．３．２抗體的純化用飽和硫酸銨法純化抗ＲＣＴ多克隆抗體［９］。

２．３．３抗體效價測定用間接ＥＬＩＳＡ測定抗ＲＣＴ抗體效價，以最佳包被抗原濃度包被酶標板，從

１∶１００開始梯度稀釋抗血清，按２．３．１的ＥＬＩＳＡ步驟操作。以Ｐ／Ｎ＞２（Ｐ為陽性血清的ＯＤ４５０值，Ｎ為陰性血清的ＯＤ４５０值），說明有抗體產生。

３結果與分析

３．１抗血清的鑒定

３．１．１最佳包被濃度的確定由表１可見，經測定，ＢＳＡ－ＲＣＴ為１００μｇ／ｍＬ時，ＯＤ４５０值為１．０００。因此確定１００ μｇ／ｍＬ為最佳包被濃度。

３．２．２抗體純化結果由圖１可見，純化后的抗體呈現出一條條帶，相對分子質量約為６６ kＤ，說明純化后抗體純度很高且沒有雜物。

３．２．３抗ＲＣＴ抗體效價測定經間接ＥＬＩＳＡ法測定，抗ＲＣＴ的抗體效價為１∶１２ ８００。

３．２．４抗體產生規律經初次和兩次加強免疫后，抗體效價逐漸升高。初次免疫７ ｄ后檢測其抗體效價，Ｐ／Ｎ＜２，說明沒有抗體產生，隨著免疫次數的增多，逐漸產生抗體，至加強免疫２次后１４ ｄ，產生的抗體最多，抗體效價也達到了最高水平（圖２），經間接ＥＬＩＳＡ法檢測其效價為１∶１２ ８００。這為以后研制萊克多巴胺的免疫學檢測試劑盒及深入研究萊克多巴胺的免疫學檢測技術奠定了堅實的基礎。

參考文獻：

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