羊口瘡病毒貴州株B2L基因的克隆及其分子特征分析

摘要：根據(jù)已發(fā)表的ＯＲＦＶ Ｂ２Ｌ基因序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行Ｂ２Ｌ基因的特異性擴(kuò)增，并將其克隆到ｐＭＤ１８－Ｔ載體后進(jìn)行測序。結(jié)果表明，貴州株的Ｂ２Ｌ基因長為１ １３７ ｂｐ。核苷酸序列比較、分析，結(jié)果表明，貴州株與湖北株（ＧＵ３２０３５１）同源性最高，達(dá)９９．１％，與２００３年北美分離株（ＡＹ２７８２０８）和２００３年美國動(dòng)物園分離株（ＡＹ４２４９７１）同源性最低，為９７．１％，所推導(dǎo)氨基酸的同源性為96.3%~99.5%。說明貴州株Ｂ２Ｌ基因與參考毒株之間差異不大。該研究為貴州省羊口瘡病毒疫苗選擇提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：ＯＲＦＶ；克隆；序列分析

中圖分類號：Ｓ８５２．６５ 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）09－1842-04

Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｂ２Ｌ Ｇｅｎｅ ｏｆ Ｏｒｆ Ｖｉｒｕｓ Ｉｓｏｌａｔｅｄ ｉｎ Ｇｕｉzｈｏｕ

ＸＩＡＮＧ Ｚｈｉ－ｌｏｎｇ１，ＺＨＵＯ Ｊｉａｎ－ｈｕａ2，ＣＨＥＮＧ Ｚｈｅｎ－ｔａｏ１，3，ＸＩＡＮ Ｓｉ－ｍｅｉ１，3，ＯＵ Ｄｅ－ｙｕａｎ１，3，ＹＩＮ Ｃｈｕａｎ－ｂａｏ１，ＬＩＵ Ｔｉｎｇ－ｊｉａｎｇ１

（1.Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５，China； 2． Ｔｈｅ Ｂｕｒｅａｕ ｏｆ Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｏｆ Ｊｉｎｇｓｈａｎ Cｏｕｎｔｒｙ， Jinshan ４３１８００，Ｈｕｂｅｉ，China； 3． Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｉｎｓｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５，China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｂ２Ｌ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＯＲＦＶ ｓｔｒａｉｎ ｉｎ Ｇｅｎbａｎｋ，ｏｎｅ ｐａｉｒ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ．Ｔｈｅ Ｂ２Ｌ ｇｅｎｅ ｏｆ ｏｒｆ ｖｉｒｕｓ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＭＤ１８－Ｔ ｐｌａｓｍｉｄｓ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ． Ｔｈｅ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ １ １３７ ｂｐ． Ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ Gｕｉｚｈｏｕ strain ａｎｄ ｔｈｅ Hｕｂｅｉ strain（ＧＵ３２０３５１）ｗａｓ ９９．１％， ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Gｕｉｚｈｏｕ strain ａｎｄ ｔｈｅ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｏｒｆ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ（ＡＹ２７８２０８）ｉｎ ２００３， ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｅｄ strain ｆｒｏｍ ｖａｒｉｏｕｓ ｒｕｍｉｎａｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ａ ｚｏｏ（ＡＹ４２４９７１） ｉｎ ２００３ ｗａｓ ９７．１％． Ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｏｆ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｈａｒｅｄ ９６．３％ to ９９．５％． Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ａ ｌｉｔｔｌｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Gｕｉｚｈｏｕ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎｓ． Ｔｈｅ ｔｅｓｔ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ａ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｔｈｅ Oｒｆ ｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｆｏｒ Gｕｉｚｈｏｕ ｐｒｏｖｉｎｃｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ＯＲＦＶ； cｌｏｎｅ； sｅｑｕｅｎｃｅ aｎａｌｙｓｉｓ

羊口瘡（Ｏｒｆ）是由羊口瘡病毒（Ｏｒｆ ｖｉｒｕｓ，ＯＲＦＶ）引起的綿羊、山羊的一種接觸傳染性、嗜上皮性、人獸共患的傳染病［１］。ＯＲＦＶ在養(yǎng)羊的國家和地區(qū)普遍發(fā)生，常呈群發(fā)性流行［２］，是嚴(yán)重威脅養(yǎng)羊業(yè)，具有重要經(jīng)濟(jì)意義的病毒病之一［３］。我國甘肅、寧夏、四川、江蘇、云南、青海、陜西、山東、內(nèi)蒙、新疆、貴州、黑龍江等省區(qū)均有此病的流行與報(bào)道［４－９］。ＯＲＦＶ為痘病毒科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）、副痘病毒屬（Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ）成員，為有囊膜線性雙股ＤＮＡ病毒，基因組大小約１３５．０～１４８．１ｋｂ［１０］， Ｇ＋Ｃ含量約６４％［１１］；目前公認(rèn)含１６個(gè)開放閱讀框（ＯＲＦ），由１３０個(gè)編碼結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白的基因組成。在ＯＲＦＶ基因組中，ＢａｍＨⅠ酶切片段的Ｂ２Ｌ基因（靠近Ｇ和Ｅ片段，距基因末端約１０ ｋｂ處，長約１ １３７ ｂｐ）是一個(gè)完整的閱讀框，Ｂ２Ｌ基因編碼４２ ｋＤａ蛋白質(zhì)。該蛋白是病毒囊膜的成分之一，可刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)，并刺激淋巴細(xì)胞釋放［１２］，是ＯＲＦＶ的保護(hù)性抗原之一［１３］，４２ ｋＤａ蛋白誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)足以抵抗強(qiáng)毒的攻擊。本試驗(yàn)針對羊口瘡病毒的Ｂ２Ｌ基因設(shè)計(jì)特異性的引物，對貴州株進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，并進(jìn)行分子特征分析，旨在了解羊口瘡貴州株與國內(nèi)毒株及國際毒株間的差異，以便深入了解羊口瘡貴州株的分子特性，為羊口瘡的診斷及防治奠定基礎(chǔ)。

１材料與方法

１．１材料

ＯＲＦＶ貴州分離株采自于鎮(zhèn)遠(yuǎn)某發(fā)病羊場，由貴州省動(dòng)物疫病研究室實(shí)驗(yàn)室保存。

１．２引物

本試驗(yàn)參考ＧｅｎBａｎｋ中的ＯＲＦＶ的Ｂ２Ｌ基因的全基因序列，設(shè)計(jì)了１對特異性引物為：ＯＲＦＶ（Ｆ）：５′－ＡＴＧＴＧＧＣＣＧＴＴＣＴＣＣＴＣＣＡＴＣ－３′；ＯＲＦＶ（R）：５′－ＴＴＡＡＴＴＴＡＴＴＧＧＣＴＴＧＣＡＧＡＡＣＴ－３′。預(yù)期目的片段為１ １３７ ｂｐ。以上由寶生物工程（大連）有限公司合成。

１．３病毒ＤＮＡ的抽提

將病料痂皮研磨，按１∶１０的體積比加入含雙抗（青霉素、鏈霉素各２ ０００ ＩＵ／ｍＬ）的０．０１ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ值７．２ ＰＢＳ緩沖液中，置４℃冰箱浸漬１２～１６ ｈ，

１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，取上清，采用ＳＤＳ－蛋白酶Ｋ法提取ＤＮＡ。

１．４ＰＣＲ擴(kuò)增

ＰＣＲ反應(yīng)體系如下：ｄｄＨ２Ｏ ３３ μＬ，１０ × ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ，ｄＮＴＰｓ（各１０ ｍｍｏｌ／Ｌ）１ μＬ，ＭｇＣｌ２（２５ ｍｍｏｌ／Ｌ）３ μＬ，上、下游引物各２．５ μＬ（１０ ｐｍｏｌ／μＬ），模板２ μＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶１ μＬ（２．５ Ｕ／μＬ），總體積為５０ μＬ。ＰＣＲ反應(yīng)條件為：９４℃預(yù)變性５ ｍｉｎ；９４℃變性１ ｍｉｎ，５５℃退火４５ ｓ，７２℃延伸１ ｍｉｎ，３５個(gè)循環(huán)后，７２℃延伸１０ ｍｉｎ。取擴(kuò)增產(chǎn)物８ μＬ，于含有０．５ ｍｇ／Ｌ溴化乙錠的１％瓊脂糖凝膠上電泳檢測。

１．５ＰＣＲ產(chǎn)物回收、連接轉(zhuǎn)化

參照寶生物膠回收試劑盒說明書進(jìn)行。

１．６擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆

取適量目的片段，加入ｐＭＤ１８－Ｔ載體及高效連接液（ｌｉｇａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎⅠ），于１６℃連接過夜，取１０ μＬ連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)ＤＨ５α菌，涂布于含Ｘ－ｇａｌ、ＩＰＴＧ和Ａｍｐ的ＬＢ固體平板上，３７℃培養(yǎng)１２～１６ ｈ。經(jīng)藍(lán)白斑篩選轉(zhuǎn)化菌，ＳＤＳ堿裂解法小劑量制備質(zhì)粒ＤＮＡ。

１．７重組質(zhì)粒的ＰＣＲ鑒定

以質(zhì)粒ＤＮＡ為模板，對重組質(zhì)粒進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增。

１．８重組質(zhì)粒的酶切鑒定

用ＢａｍＨⅠ和ＨｉｎｄⅢ酶切重組質(zhì)粒（３７℃酶切３ ｈ），１％瓊脂糖凝膠電泳觀察酶切結(jié)果。

１．９核酸序列測定

采用Ｓａｎｇｅｒ’ｓ雙脫氧鏈終止法測序，將２個(gè)反應(yīng)所測序列用ＤＮＡＳｔａｒ軟件包中的Ｓｅｑｍａｎ軟件對比矯正，并用ＤＮＡＳｔａｒ的ＭｅｇＡｌｉｇｎ軟件對所測核酸序列進(jìn)行比較和分析。

２試驗(yàn)結(jié)果

２．１ＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果

用設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增本實(shí)驗(yàn)室保存的羊口瘡病毒，將擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，得到與預(yù)期相符的１ １３７ ｂｐ片段（圖１）。

２．２重組質(zhì)粒ＰＣＲ鑒定結(jié)果

用設(shè)計(jì)的特異引物對重組質(zhì)粒進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，得到與預(yù)期相符的１ １３７ ｂｐ片段，結(jié)果見圖２。

２．３重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

用限制性內(nèi)切酶ＨiｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ對重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，３７℃ 3 ｈ后，用瓊脂糖凝膠電泳分析酶切結(jié)果，結(jié)果顯示切出ｐＭＤ１８－Ｔ載體的２ 70０ ｂｐ和Ｂ２Ｌ基因的１ ２００ ｂｐ兩條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（圖３）。

２．４序列測定結(jié)果

將經(jīng)ＰＣＲ鑒定為陽性重組質(zhì)粒的克隆菌送寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行序列測定，并應(yīng)用計(jì)算機(jī)軟件對測得的序列進(jìn)行拼接，獲得ＯＲＦＶ貴州株Ｂ２Ｌ基因核苷酸序列，Ｂ２Ｌ基因的長度為１ １３７ ｂｐ，其核苷酸序列見圖４。

２．４．１貴州分離株與其他分離株核苷酸同源性 將本試驗(yàn)克隆測序的１株貴州分離株與１７株Ｇｅｎｂａｎｋ中已發(fā)表的羊口瘡Ｂ２Ｌ基因進(jìn)行比較分析，與Ｇｅｎｂａｎｋ中已發(fā)表羊口瘡序列間的核苷酸同源性為９７．１％～99.1%（圖５）。

２．４．２貴州分離株與其他分離株氨基酸同源性本試驗(yàn)克隆測序的羊口瘡貴州株Ｂ２Ｌ基因與ＧｅｎBａｎｋ中已發(fā)表的羊口瘡Ｂ２Ｌ基因進(jìn)行比較分析，與ＧｅｎBａｎｋ中已發(fā)表的羊口瘡序列間的氨基酸同源性為９6．3％～９９．５％（圖６）。

２．４．３遺傳進(jìn)化樹分析用Ｏｌｉｇｏ軟件繪制羊口瘡病毒Ｂ２Ｌ基因的遺傳進(jìn)化樹，經(jīng)分析，貴州株與ＧｅｎBａｎｋ中已發(fā)表的中國臺灣２００７年分離株（登錄號：ＤＱ９０４３５１）和中國湖北２００９年分離株（登錄號：ＧＵ３２０３５１）的序列為同一病毒株，與２００５年分離于印度山羊的口瘡病毒同屬于一個(gè)進(jìn)化分支（登錄號：ＤＱ2６３３０３和ＤＱ2６３３０４）（圖７）。

３分析

１）羊口瘡病毒基因組全長約１３５．０～１４８．１ ｋｂ，不同種、不同毒株略有差異［３］。Ｂ２Ｌ基因編碼約４２ ｋＤａ的蛋白，此蛋白是ＯＲＦＶ的囊膜成分，為主要保護(hù)性抗原之一，可刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)。本研究對貴州分離株ＯＲＦＶ Ｂ２Ｌ基因的測序及分子特征分析，為貴州省的疫苗選擇提供理論依據(jù)。

２）本研究通過提取羊口瘡病毒ＤＮＡ進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增、克隆、分子特征分析，成功地獲得了Ｂ２Ｌ基因編碼序列，共１ １３７ ｂｐ，編碼３７９個(gè)氨基酸，與國內(nèi)外已發(fā)表的羊口瘡病毒Ｂ２Ｌ基因核苷酸序列同源性高達(dá)９９．１％；推導(dǎo)的氨基酸序列與羊口瘡病毒Ｂ２Ｌ基因編碼的氨基酸同源性高達(dá)９９．５％。從同源性的分析結(jié)果來看，本試驗(yàn)所研究的１株羊口瘡病毒貴州分離株與ＧｅｎBａｎｋ收錄的１７株羊口瘡毒株該片段的同源性非常高，這說明Ｂ２Ｌ基因具有高度的保守性。

３）在本試驗(yàn)中，以所提取的ＤＮＡ為模板，ＯＲＦＶ１、ＯＲＦＶ２為引物，ＰＣＲ擴(kuò)增得到了一條約

１ １３７ ｂｐ的特異條帶，與試驗(yàn)設(shè)計(jì)的預(yù)期結(jié)果一致。用限制性內(nèi)切酶ＨiｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ對ＰＣＲ產(chǎn)物進(jìn)行的雙酶切鑒定結(jié)果表明，酶切產(chǎn)物中出現(xiàn)２條帶，大小分別為２ ７００ ｂｐ的ｐＭＤ１８－Ｔ的線性片段和約１ ２００ ｂｐ的插入片段，這與測序結(jié)果相符合，表明在本試驗(yàn)中已獲得了羊口瘡病毒的Ｂ２Ｌ基因。本研究不僅為病毒分子生物學(xué)特性的研究提供了參考依據(jù)，還為原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)產(chǎn)物的免疫生化特性的研究、真核表達(dá)載體的構(gòu)建并作為核酸疫苗防治羊口瘡病毒奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

［１］ 殷震，劉景華．動(dòng)物病毒學(xué)［Ｍ］．北京：科學(xué)出版社，１９９７．９７７－９８０．

［２］ 左玉婷，靳誠，王錫貞．羊傳染性膿皰皮炎［Ｊ］．中國獸醫(yī)科技，１９８７（３）：５６－５８．

［３］ 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所．動(dòng)物傳染病學(xué)［Ｍ］．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，１９９８．３６３－３６５．

［４］ 丁久耐，于瑞順．青龍縣羊傳染性膿皰病調(diào)查報(bào)告［Ｊ］．河北畜牧獸醫(yī)，１９８６（１）：５－１７．

［５］ 丁再隸，何家惠， 劉立仁． 羊傳染性膿皰皮炎在江蘇的首次確診［Ｊ］．畜牧與獸醫(yī)，１９９２（２）：７６．

［６］ 改樹清，劉慧純，王志明．羊傳染性膿皰口炎的調(diào)查報(bào)告［Ｊ］．黑龍江畜牧獸醫(yī)，１９８３（４）：４－８．

［７］ 何水林，陳杰，蔡玉書．羊口瘡病毒的分離鑒定［Ｊ］．中國獸醫(yī)科技，２００２（９）：２２－２３．

［８］ 王明珠，于春林，白斯琴，等．羊傳染性膿皰的流行與防治［Ｊ］．中國獸醫(yī)雜志，２００２（１０）：４９－５０．

［９］ 徐毅，陳無暇，王光偉．山羊爆發(fā)傳染性膿皰皮炎［Ｊ］．中國獸醫(yī)雜志，２００２（３）：４７－４８．

［１０］ ＧＡＳＳＭＡＮＮ Ｕ，ＷＹＬＥＲ Ｒ，ＷＩＴＴＥＫ Ｒ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐａｒａｐｏｘｖｉｏｕｓ ｇｅｎｏｍｅｓ［Ｊ］．Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ，１９８５，８３（１－２）：１７－３１．

［１１］ ＲＯＢＩＮＳＯＮ Ａ Ｊ，ＢＡＲＮＳ Ｇ，ＦＲＡＳＥＲ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｏｒｆ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅｓ［Ｊ］． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９８７，１５７（１）：１３－２３．

［１２］ 黃引賢，李乃津．羊傳染性膿皰病毒的某些特性的初步研究［Ｊ］．中國獸醫(yī)雜志，１９８６，１２（４）：２－５．

［１３］ ＳＵＬＬＩＶＡＮ Ｊ Ｔ，ＭＥＲＣＥＲ Ａ Ａ，ＦＬＥＭＩＮＧ Ｓ Ｂ，ｅｔ ａl． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｏｒｆ ｖｉｒｕｓ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｏｆ ｔｈｅ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｐ３７Ｋ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９４，２０２（２）：９６８－９７３．