大型艾美耳球蟲18S rDＮA部分序列測定與系統發育分析

摘要：從河北某兔場分離大型艾美耳球蟲卵囊，ＣＴＡＢ法提取基因組ＤＮＡ。利用艾美耳屬球蟲１８Ｓ ｒＤＮＡ保守引物，ＰＣＲ擴增大型艾美耳球蟲１８Ｓ ｒＤＮＡ片段，產物純化后測序。將測得的序列用ＤNASｔａｒ軟件分析并與ＧｅｎBａｎｋ中公布的１１種兔球蟲的相應序列進行同源性比較，繪制系統進化樹。結果表明，擴增出大小約為１ ５２２ ｂｐ的１８Ｓ ｒＤＮＡ片段，序列分析顯示河北株大型艾美耳球蟲１８Ｓ ｒＤＮＡ與ＧｅｎBａｎｋ 公布的大型艾美耳球蟲１８Ｓ ｒＤＮＡ比對，同源性達９９．６％；與國外的１１種兔球蟲相應序列同源性在９２．４％～９９．６％之間。

關鍵詞：大型艾美耳球蟲；１８Ｓ ｒＤＮＡ；測序；系統發育分析

中圖分類號：Ｓ８５２．７２＋３ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）09－1838-04

Ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １８Ｓ ｒＤＮＡ ｆｒｏｍ Ｅimeria ｍａｇｎａ

ＦＡＮＧ Ｓｕ－ｆａｎｇ，ＧＵ Ｘｉａｏ－ｌｏｎｇ，ＣＵＩ Ｐｉｎｇ

（Ｃｏｌｌｏｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈｅｂｅｉ Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｚｈａｎｇjｉａｋｏｕ ０７５０００，Ｈｅｂｅｉ，China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｏｏｃｙｓｔ ｏｆ Ｅimeria ｍａｇｎａ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｒａｂｂｉｔ ｆａｒｍ ｉｎ Ｈｅｂｅｉ． Ｉｔｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ＣＡＴＢ． Ｔｈｅ １８Ｓ ｒＤＮＡ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ Ｅ． ｍａｇｎａ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｐｒｉｍｅｒ ｏｆ １８Ｓ ｒＤＮＡ ｏｆ Ｅｉｍｅｒｉａ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ． Ｔｈｅｎ ｉｔ ｗａｓ ａｎａｌｙｓｅｄ ｂｙ ＤNASｔａｒ ｐｒｏｇｒａｍ ｐａｃｋａｇｅ ａｎｄ ｗａｓ ａｌｉｇｎｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｅｌｅｖｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｒａｂｂｉｔ－ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ Ｅｉｍｅｒｉａ ｉｎ ｔｈｅ ＧｅｎBａｎｋ． Ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗａｓ about １ ５２２ ｂｐ． Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ １８Ｓ ｒＤＮＡ ｏｆ Ｅ． ｍａｇｎａ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｅｂｅｉ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ E. magna publicized in GenBank ｗａｓ ｍｏｓｔ ｃｌｏｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｗａｓ ｕｐ ｔｏ ９９．６％； and the monology between Hebei E. magna and the other 11 kinds of Eimeria infecting overseas rabbit was 92.4%~99.6%．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｅ． ｍａｇｎａ； １８Ｓ ｒＤＮＡ； sｅｑｕｅｎｃｅ； pｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ aｎａｌｙｓｉｓ

兔球蟲種類的鑒定，傳統方法是以卵囊形態、致病性、寄生部位、腸道病變特征等為鑒別指標［１］，現在仍然用于兔球蟲病的流行病學等研究。實踐證明，單純形態學鑒定存在一些不足，一方面由于球蟲受到遺傳和環境等因素的影響，這些鑒別指標有時會發生變化，因而不能作為蟲種鑒別的精確指標［２］；另一方面研究過程中不同研究者對同一性狀的認知存在主觀差異，而且少數形態特征和生理生化指標隨著環境的變化而不穩定，造成球蟲分類鑒定上的分歧，這就給該病的診斷與防治帶來了困難。

我國對于兔大型艾美耳球蟲分子生物學特性研究的相關報道較少。因此，本研究在大型艾美耳球蟲形態學鑒定的基礎上，對大型艾美耳球蟲目的基因１８Ｓ ｒＤＮＡ采用軟件設計一對引物進行ＰＣＲ擴增，通過系統發育分析進一步確立大型艾美耳球蟲種。

１材料與方法

１．１儀器及設備

梯度ＰＣＲ擴增儀（美國熱電公司，ＩＳ－５５８０３）、高速冷凍離心機（湖南星科科技有限公司，ＴＧＬ－１６ＬＧ）、電泳儀（北京市六一儀器廠，型號ＤＹＹ－２Ｃ）、紫外透射儀（北京市六一儀器廠，型號ＷＤ－９４０３Ｄ）。

１．２球蟲ＤＮＡ模板的制備

將事先分離純化好的大型艾美耳球蟲卵囊（河北株）３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，棄掉上清后計數，以卵囊數達到５×１０５個／ｍＬ時即可用于基因組ＤＮＡ的提取。取５×１０５個卵囊加入到中號組織研磨器中進行研磨，當９０％卵囊壁破碎后加入１ ｍＬ卵囊裂解液分裝于１．５ ｍＬ離心管中，６５℃作用３ ｈ，隨后采用酚－氯仿抽提，異丙醇沉淀ＤＮＡ［３］，沉淀用５０ μＬ ＴＥ溶解。

１．３ＰＣＲ反應體系

根據Ｋｖｉｃｅｒｏｖａ等［4］報道的１８Ｓ ｒＲＮＡ基因序列，設計大型艾美耳球蟲引物為：

上游５’－ＴＡＧＴＴＧＧＡＴＴＴＣＴＧＴＣＧＴＧＧＴＣ－３’；下游５’－ＣＣＴＴＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＡＡＧ－３’。由寶生物工程（大連）有限公司合成。

擴增體系：１０ × ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ （Ｍｇ２＋）２．５ μＬ，ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ （10 ｐｍｏｌ／μL）２ μＬ，引物（２０ ｐｍｏｌ／μL）０．５ μＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶 ０．２５ μＬ，模板ＤＮＡ １ μＬ， 補加去離子水至總體積為２５ μＬ。

反應條件：９４℃預變性４ ｍｉｎ進入循環，９４℃變性１ ｍｉｎ，５９℃退火４５ ｓ，７２℃延伸１ ｍｉｎ，共３０個循環，最后７２℃延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ產物經３％瓊脂糖凝膠電泳，通過紫外透射儀觀察并記錄結果［３，４］。用

ＤＮＡ回收試劑盒［購自寶生物工程（大連）有限公司］回收，ＰＣＲ產物送寶生物工程（大連）有限公司直接測序。

１．４ＰＣＲ產物測序、比對

將從河北兔糞中分離的大型艾美耳球蟲ＰＣＲ產物送寶生物工程（大連）有限公司，下游引物單向測序，測序結果與ＧｅｎBａｎｋ發布的兔大型艾美耳球蟲１８Ｓ ｒＤＮＡ序列（登錄號：ＥＦ６９４０１６）進行比對。

１．５系統發育分析

應用ＤNAｓｔａｒ軟件中的ＣｌｕｓｔａｌＷ方法將測

序結果與ＧｅｎBａｎｋ發布的兔大型艾美耳球蟲

１８Ｓ ｒＤＮＡ序列進行序列同源性分析，并繪制系統發育進化樹。

２結果

２．１ＰＣＲ擴增結果

ＰＣＲ擴增結果顯示該株卵囊擴增出清晰的目的條帶，約１ ５２２ ｂｐ，無其他非特異性條帶出現（圖１）。

２．２ＰＣＲ產物測序

河北株大型艾美耳球蟲ＰＣＲ產物經寶生物工程（大連）有限公司測序，結果見圖2。

２．３序列比對

本次共測得１ ４４０個堿基，序列比對結果顯示，河北株大型艾美耳球蟲的１８Ｓ ｒＤＮＡ部分基因與GenBank發布的兔大型艾美耳球蟲１８Ｓ ｒＤＮＡ同源性達９９．6％，共有８處變異，其對應位置分別為：７０Ｇ→Ｓ， ７９Ｔ→Ｃ、 ５４５Ｃ→Ａ，９６３Ｔ→Ｃ， 在１ ４０８、

１ ４１４、１ ４２２、１ ４２３位分別插入了Ｃ、Ａ、Ｃ、Ｔ四個堿基。詳細結果見圖3。

２．４國外１１種兔球蟲與河北株大型艾美耳球蟲１８Ｓ ｒＤＮＡ序列同源性和趨異性

通過將河北株大型艾美耳球蟲１８Ｓ ｒＤＮＡ序列與國外１１種兔球蟲進行同源性和趨異性比較，結果顯示，河北株大型艾美耳球蟲與國外１１種兔球蟲相應序列同源性為９２．４％～９９．６％之間，其中與國外Ｅ． ｍａｇｎａ和Ｅ． ｐｅｒｆｏｒａｎｓ同源性最高（９９．６％）；與Ｅ． ｓｔｉｅｄａｉ同源性最低（９２．４％），詳細結果見表1。

２．５系統發育分析

應用ＤＮＡsｔａｒ軟件進行序列同源性分析，并繪制系統發育進化樹（圖4）。由圖4可見，ＨＢ． ｍａｇｎａ和Ｅ． ｍａｇｎａ為同一分支，說明ＨＢ． ｍａｇｎａ與Ｅ．ｍａｇｎａ親緣關系最近。

３討論

１）１８Ｓ ｒＤＮＡ具有高度保守性的特點，該基因序列差異大小代表了物種差異大小，國際上廣泛應用其來確定物種的分類地位。對大型艾美耳球蟲河北分離株進行１８Ｓ ｒＤＮＡ的測定，１ ５２２ ｂｐ序列測定結果與GenBank發布的兔大型艾美耳球蟲１８Ｓ ｒＤＮＡ部分序列比對，同源性達９９．６％。這個研究結果不僅有助于確定國內兔球蟲的遺傳進化關系［４］，而且進一步表明分離株為大型艾美耳球蟲種。

２）傳統上兔球蟲種類的鑒定仍以兔球蟲卵囊形態和生物學特征（致病性、病變特征、免疫原性、內生性發育等）作為主要鑒定指標，實踐中此方法存在一些不足，尤其在確定球蟲的生物學特性時，不僅費時、費力而且存在一些主觀因素的影響。系統發育的意義在于建立分類系統和確定親緣關系［４］，但只根據其１８Ｓ ｒＤＮＡ親緣關系相似程度，也很難鑒別兔球蟲種類，如梨形艾美耳球蟲和黃艾美耳球蟲兩個種（同源性達９９．６％）具有幾乎一致序列的１８Ｓ ｒＤＮＡ，不能由此確定它們是一個種。本研究在形態學觀察大型艾美耳球蟲基礎上根據系統發育分析結合親緣關系進一步確定球蟲種類。在沒有建立起快速、靈敏、可靠的分子生物學方法之前，應用形態學鑒定和系統發育分析鑒定兔球蟲種類具有一定的價值。

３）在提取卵囊基因組ＤＮＡ時，卵囊壁的破碎方法有多種，分別為玻璃珠法［３］、超聲波法［５］及研磨器法［６］等。本試驗也曾用超聲波來破碎卵囊壁，在１００Ｗ下，５ｓ／次，間斷的超聲大約需１ ｈ才能將９０％以上的卵囊壁破碎，破碎時間太長。而研磨器只需約７ ｍｉｎ即可使９０％以上的卵囊壁破碎。在使用研磨器時用研磨器管底部分進行研磨，同時將研磨器置于冰浴中研磨，這樣會減少蟲卵基因組ＤＮＡ的降解。

參考文獻：

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