棉花黃萎病拮抗菌的篩選及定殖效果初步研究

摘要：對１２０株棉花內生菌對棉花黃萎病菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｉｌａｅ）的抑制作用進行了研究，篩選出能夠對病原菌產生抑制或拮抗作用的菌株。發現１5．8％的菌株對病原真菌有一定拮抗作用，具有強拮抗作用的菌株有３株，選取拮抗作用最強的Ｓ１１菌株進行棉苗入侵定殖效果研究，結果顯示，采用菌液澆灌的方式，能從棉苗的根、上胚軸、下胚軸和子葉中分離發現菌株，在４種接種方式中菌株定殖效果最好。

關鍵詞：拮抗菌；棉花黃萎??；篩選；定殖

中圖分類號：Ｓ４３５．６２１ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）09－1800-03

Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ for Antagonistic Strains Against Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｉｌａｅ ａｎｄ Pｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Sｔｕｄｙ on the Cｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ Eｆｆｅｃｔ

ＦＡＮ Ｙｕ－ｇａｎｇ，ＷＡＮＧ Ｍｉ，ＷＡＮＧ Ｗｅｉ－ｄｏｎｇ，ＬＩＵ Ｎｉａｎ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｙａｎｇｔｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎｇｚｈｏｕ ４３４０２５，Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Aｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉum ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ out ｏｆ １２０ entophyte ｓｔｒａｉｎｓ ｆｒｏｍ ｃｏｔｔｏｎ． Ｉｔ ｗａｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ １5.8% ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｈａd ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ， among which ｔｈｒｅｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｈａd ｇｏｏｄ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ Ｓ１１ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｉｎ ｃｏｔｔｏｎ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ bａｃｔｅｒｉａ lｉｑｕｉｄ ｉｒｒｉｇａｔｉｏｎ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈe ｂｅｓｔ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ ｃｏｔｔｏｎ. Ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｃｏｕｌｄ be ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｒｏｏｔｓ， ｅｐｉｃｏｔｙｌ， ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ ａｎｄ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ ｏｆ ｃｏｔｔｏｎ． Among the 4 inoculation mehtod， fix planting has bdst efficiency.

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ； Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｉｌａｅ； ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ； ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ

自１８９８年Ｖｏｇｌ從黑麥草種子內分離出第一株內生真菌以來，植物內生菌作為一種新的微生物資源受到了廣泛的關注，從內生菌中尋找和發現新的活性化合物已成為國內外研究的又一熱點。近年來，該領域的研究已取得一定進展，發現了一些有醫用、農用價值的菌株和化合物［１］。

棉花黃萎病屬于土傳病害，防治極為困難。目前防治棉花黃萎病的物理、化學方法的效果都不理想，采用生物防治棉花黃萎病逐步取得較好的效果，且對環境無污染。利用生防菌的拮抗作用可以有效地抑制致病菌的生長，內生拮抗菌定殖于植物體內，作為生防菌有極大的優勢［２］。從棉花組織中分離篩選到一株具有強拮抗作用的菌株Ｓ１１，用不同的方法將其接種到棉苗上，研究不同入侵途徑的定殖效果，以期為棉花黃萎病的生物防治提供有效參考。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１供試菌株供試內生菌菌株：采用表面消毒后稀釋磨平板的方法從湖北荊州棉株樣品中分離出１２０株內生菌株（表１）。病原真菌：棉花黃萎病菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｉｌａｅ）菌株由南京農業大學實驗室提供。

１．１．２儀器與藥品儀器：千分尺，移液槍，打孔器，藥匙，高壓蒸汽滅菌鍋，電熱恒溫鼓風干燥箱，水浴鍋，隔水式恒溫培養箱，生化培養箱，恒溫搖床，離心機，育苗盤等；培養基：ＰＤＡ培養基、ＰＤ液體培養基、ＮＡ培養基；滅菌無土育苗混配基質（專利號２００７１００５３５８３．４）；棉花種子：鄂雜棉１０號棉子。

１．２方法

１．２．１平皿對峙法采用平皿對峙培養法進行內生菌和病原真菌間的皿內拮抗試驗［３］。在ＰＤＡ平板上以原點為中心劃垂直的十字，分別將病原真菌和內生菌沿一條直線等距離接種于平板兩側，以中央只接種病原真菌的平板為對照（ＣＫ）。放于培養箱中２８ ℃培養，２～７ ｄ后觀察菌落生長情況。并測定抑菌帶寬度。將抑菌帶寬度大于10 ｍｍ作為強抑菌作用菌株（＋＋＋），抑菌帶寬度為５～10 ｍｍ作為中強抑菌作用菌株（＋＋），抑菌帶寬度小于５ ｍｍ作為弱抑菌作用菌株（＋）。

１．２．２生長速率法將初選拮抗菌株接種于ＮＡ培養液中，２５ ℃條件下置轉速１４０ ｒ／ｍｉｎ的搖床上培養３～６ ｄ，將培養液１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心３０ ｍｉｎ，取上清發酵液。將發酵液以體積比１∶１0加入ＰＤＡ培養基中制成平板（直徑９０ ｍｍ），以加等量無菌水的平板為對照，用打孔器在平板中央接種病原菌菌餅，菌餅直徑５ ｍｍ，２５ ℃下培養４ ｄ，測量各處理菌落直徑，計算各菌株發酵液對病原菌的抑制率［４］。

內生菌對病原菌的生長抑制率＝（對照菌落半徑Ｒｃ－處理菌落半徑Ｒｐ）／對照菌落半徑Ｒｃ×１００％

１．２．３菌株的接種方法將篩選出的拮抗作用最強的菌株，移至ＮＡ培養液中，３０ ℃下振蕩培養２ ｄ，用無菌水配成１０８ ＣＦＵ／ｍＬ的菌體懸浮液，備用［５］。①浸種接種：將棉花種子浸入３０ ℃的菌體懸浮液中６ ｈ，播種在滅菌的棉花無土育苗基質中；②澆灌接種：用菌體懸浮液按３０ ｍＬ／株的量淋到苗根部和育苗基質中；③噴霧接種：棉種出苗后，用噴霧器將菌體懸浮液按２ ｍＬ／株的量均勻噴灑到棉苗葉面上；④針刺接種：分別用大頭針將棉苗植株的莖和葉部刺傷，蘸上篩選出的菌體懸浮液。按以上接種方法接種后均放置在溫光培養箱內３０ ℃環境中生長。每處理３次重復，各試驗均以滅菌水作為相應對照。

１．２．４接種菌的回收分別剪取以不同接種方法接種的棉苗植株４個部位各５ ｇ，滅菌水沖洗干凈，剪成５ ｍｍ × ５ ｍｍ的組織塊，在體積分數為７５％的酒精中浸泡１ ｍｉｎ，然后用質量分數為０．１％的升汞消毒３ ｍｉｎ，滅菌水沖洗３次，取消毒后最后一次沖洗液１ ｍＬ置于滅菌培養皿中，倒入４５ ℃的ＮＡ培養基，充分搖勻。２８ ℃下培養３ ｄ，觀察有無菌落產生，驗證消毒是否將供試材料表面的微生物全部殺死。將供試材料于滅菌的研缽中研磨，用無菌水稀釋成１０－２、１０－３和１０－４的濃度，分別移?。?ｍＬ，倒入４５ ℃含有２００ μｇ／ｍＬ鏈霉素的ＮＡ培養基，充分搖勻后在２８ ℃下培養３ ｄ，經生理生化測定和棉花黃萎病的拮抗測定以確定其是否接種的目標菌株。

２結果與分析

２．１棉花內生菌對病原菌的抑制效果

通過對１２０株內生菌與病原菌的對峙培養，其中有１９株內生菌表現出一定的抑制作用，占到供試菌株的15.8％。其中抑菌帶寬度最小的為１．５ｍｍ，抑制作用最??；產生抑制作用的菌株中大多為中等抑菌強度；抑菌帶寬度較大的菌株有Ｓ３、Ｓ１１和Ｒ２０，分別達到了１１．５、１０．５和１０．０ ｍｍ，抑菌作用較強（表２）。其他菌株因沒有明顯的抑菌帶，故未列入表２中。

２．２內生菌對病原菌的抑制率

對初選出的１９個內生菌發酵液的抑菌活性測定結果表明，所有發酵液處理的病原菌菌落直徑均小于空白對照，說明其對棉花黃萎病菌都有明顯的抑制作用。各菌株抑制率在２１．１％～９１．０％。試驗菌株Ｌ９發酵液抑菌率為２１．１％，抑菌活性較差；菌株Ｓ３和Ｒ２０抑菌活性較強，抑菌率分別達到89.6%和88.2%；菌株Ｓ１１、Ｒ２７抑菌活性都達到了９０％以上，對病菌的抑制作用明顯強于其他菌株，其中Ｓ１１的抑菌活性最佳（表３）。

２．３菌株的定殖效果

結果表明，Ｓ１１菌株均可通過這４種接種方法入侵定殖于棉苗。經浸種、澆灌和針刺處理的棉苗植株，其根部、上下胚軸均發現有Ｓ１１菌株存在，其中，根部菌量較多，上胚軸和下胚軸菌量較少，葉片（包括子葉）沒有發現Ｓ１１菌株；噴霧處理的棉苗除了葉上存在少量菌株外，其他部位沒有發現菌株的存在。澆灌處理根部菌量較大，浸種處理的根部菌量中等，說明根部是容易被內生拮抗菌入侵定殖的部位。試驗結果表明，Ｓ１１菌株可以通過浸種的方式定殖，也可以通過棉苗的根、上下胚軸、葉表皮進入植株內（表４）。

３結論與討論

３．１結論

經過皿內拮抗試驗，從棉株樣品中所分離的１２０株菌株中有１９株對棉花黃萎病菌有拮抗能力。即有１5．8％的菌株對病原真菌有一定拮抗作用，有強拮抗作用的菌株有３株，其中菌株Ｓ１１對棉花黃萎病菌的抑制率達到９１．０％。

對菌株Ｓ１１進行入侵棉株定殖效果試驗，發現用浸種、澆灌、噴霧、針刺等方法把菌株接種到棉苗，均能從棉苗的根、上胚軸、下胚軸和葉中發現菌株，其中澆灌的效果最佳，其次是浸種以及針刺效果。用噴霧處理只在葉中有少量菌株，效果較差。

３．２討論

本研究只是初步在數量上測定了對棉花黃萎病有抑制作用的內生菌株，所分離出的內生菌生理生化特征未進行測定，且內生真菌對病原菌產生拮抗作用的化學物質也需進一步分離分析。試驗用浸種、澆灌處理的棉花植株，不但從根部分離到目標菌株，從棉苗植株的上下胚軸和葉部也分離到該菌；而用針刺接種的植株可以從根部分離到Ｓ１１菌株，說明該菌能在棉苗植株的不同部位相互轉移，但是轉移的方式及原因有待進一步探討；一般認為，內生菌只有在植株發生創傷時，才能入侵定殖［６］，但本試驗所用無土基質經過滅菌處理，排除了基質中病蟲害造成的外傷所致內生菌入侵，棉花苗期取樣時并未發現創傷，而檢測結果卻顯示內生菌已入侵定殖，具體原因需進一步研究。

參考文獻：

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