一株耐熱脂肪酶產生菌XD-23的酶學性質研究

一株耐熱脂肪酶產生菌ＸＤ－２３的酶學性質研究

李紅寧１，２，楊滟菊２

（１．六盤水師范學院生物與地理科學系，貴州 六盤水５５３００４；２．云南師范大學生命科學學院， 昆明６５００９２）

摘要：從云南尋甸油污樣中獲得１株產脂肪酶的菌株ＸＤ－２３，研究了該菌株的酶學性質。結果表明，該菌株所產脂肪酶的最適反應溫度為６０℃，最適反應ｐＨ值為６．０，為高溫中性酶；酶活力在ｐＨ值４．０～７．０范圍內較穩定，有一定的耐酸性；在６５℃保溫３０ ｍｉｎ酶活力保留７０％，具有良好的熱穩定性。金屬離子Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、Ｋ＋對酶活力有促進作用，Ｚｎ２＋、Ｐｂ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ａｌ３＋、Ｃｕ２＋對酶活力有抑制作用，ＥＤＴＡ、Ｎａ＋、Ｍｇ２＋對酶活力影響不大；表面活性劑中ＥＤＴＡ對該酶有較小的抑制作用，濃度為０．１、０．５ g/L的ＳＤＳ能明顯抑制該酶的活性，濃度為０．５ mL/L的Ｔｗｅｅｎ ８０和濃度為０．１、０．５ mL/L的ＴｒｉｔｏｎＸ－１００對酶活力有促進作用。

關鍵詞：脂肪酶；酶活力；酶學性質

中圖分類號：Ｑ５５６文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）09－1773-03

Enzymatic Properties of Lipase-producing Bacteria XD-23

ＬＩ Ｈｏｎｇ－ｎｉｎｇ１，２，ＹＡＮＧ Ｙａｎ－ｊｕ２

（１． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｏｇｒａｐｈｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｌｉｕｐａｎｓｈｕｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｌｉｕｐａｎｓｈｕｉ ５５３００４， Ｇｕｉｚｈｏｕ， Ｃｈｉｎａ；

２．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｙｕｎｎａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５００９２， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ bacteria ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｌｉｐａｓｅ ｗａｓ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｆｒｏｍ ｏｉｌ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ ｓｏｉｌ ｏｆ Ｘｕｎｄｉａｎ ｉｎ Ｙｕｎｎａｎ and named XD23． Ｔｈｉｓ bacteria ｗａｓ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ ａｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ． Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＸＤ－２３ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ ６０ ℃ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ pＨ ｗａｓ ６．０． Ｉｔｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｓｔａｂｌｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐＨ４．０～７．０； ａｎｄ ｉｔ ｈａｄ ｓｏｍｅ ａｃｉｄ－ｒｅｓｉｓｔｉｎｇ ｆｅａｔｕｒｅｓ． Ｉｔ ａｌｓｏ ｈａｄ ｇｏｏｄ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ， ７０％ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｒｅｓｅｒｖｅｄ after ｂｅｉｎｇ ｋｅｐｔ ａｔ ６５ ℃ ｆｏｒ ３０ ｍｉｎｕｔｅｓ． Ｃａ２＋， Ｃｏ２＋， Ｋ＋ ｃｏｕｌｄ boost up ｉｔｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ｗｈｅｒｅａｓ Ｆｅ３＋， Ｐｂ２＋， Ｍｎ２＋， Ｃｕ２＋， Ａｌ３＋， Ｚｎ２＋ wｏｕｌｄ ｒｅｓｔｒａｉｎ ｉｔｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ｗｈｉｌｅ ＥＤＴＡ， Ｎａ＋， Ｍｇ２＋ ｈａｄ ｌｉｔｔｌｅ ｅｆｆｅｃｔ． ＳＤＳ at ０．１ g/L ａｎｄ ０．５ g/L ｃｏｕｌｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｒｅｓｔｒａｉｎ ｉｔｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ｗｈｉｌｅ Ｔｗｅｅｎ ８０ at ０．５ mL/L ａｎｄ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ at ０．１mL/L ａｎｄ ０．５mL/L ｃｏｕｌｄ strengthen ｉｔｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ ａｃｙｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ； ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ； ｌｉｐａｓｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ

脂肪酶（Ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ ａｃｙｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）又稱三酰甘油?；饷?，廣泛存在于植物、動物和微生物中。脂肪酶可在油水界面或水不溶性系統中催化酯交換、酸解、水解、胺解、轉酯、醇解、酯化等化學反應［１］，因此被廣泛應用于食品、醫藥、環保、洗滌、制革、造紙、生物化工等行業［２］。近年來應用脂肪酶法催化合成綠色能源生物柴油，已成為一個新的研究熱門［３，４］。由于脂肪酶應用潛力巨大，涉及的行業廣泛，使得脂肪酶產生菌株再一次成為各個國家生物工程的研究熱點。

微生物脂肪酶的研究為脂肪酶的應用提供了方便的材料來源途徑。微生物脂肪酶具有豐富的資源，據估計有６５個屬的微生物產脂肪酶［５］。微生物脂肪酶來源廣泛，生長周期短，可工業化大規模生產，且成本低，具有良好的發展前景。本研究通過對脂肪酶產生菌的酶學性質進行研究，尋找性能優異的耐熱、高活力、符合現代生物工程要求的脂肪酶，以期為微生物脂肪酶的生產提供優良菌株。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１菌種菌株ＸＤ－２３由云南尋甸油污樣中獲得，經鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）。

１．１．２主要試劑Ｋ２ＨＰＯ４、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ、ＣａＣＯ３、ＮａＯＨ、ＮａＣｌ、Na2HPO4·12H2O、橄欖油、酵母浸粉、蛋白胨、檸檬酸、酚酞、體積分數為９５％的乙醇、聚乙烯醇。以上試劑中聚乙烯醇購自Sｉｇｍａ公司，其余均為國產分析純。

１．１．３培養基發酵培養基：橄欖油２．５０ ｇ，蛋白胨 ３．５０ ｇ，ＣａＣＯ３ ０．２５ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０５ ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ０．１０ ｇ，定容至５０ ｍＬ，ｐＨ值７．０。

液體種子培養基：酵母粉０．５ g，蛋白胨１．０ g，氯化鈉１．０ g，定容至１００ ｍＬ，ｐＨ值６．８。

１．１．４主要儀器ＴＧ １６－Ｗ小型臺式高速離心機，長沙湘儀離心機廠；ＳＷ－ＣＪ－２ＦＤ凈化工作臺，蘇州智凈凈化設備有限公司；ＹＸ２８０Ａ手提式高壓滅菌鍋，上海三申醫療器械有限公司；２ＦＤ－５２５０恒溫鼓風干燥箱，上海智城分析儀器公司；ＹＰＷ－Ｉ回轉式恒溫調速搖瓶柜，上海通特電訊設備廠；ＧＢ１１２４０－８９恒溫水浴鍋，河北航天儀器廠；ＨＪ－４多頭磁力加熱攪拌器，金壇市億能實驗儀器廠。

１．２方法

１．２．１培養方法①種子培養。１００ ｍＬ的三角瓶裝４０～５０ ｍＬ液體種子培養基，用牙簽挑取初篩培養基中水解圈較大的單菌落于三角瓶中，于３７℃、１５０ ｒ／ｍｉｎ搖床振蕩培養１６～１８ ｈ。②產酶培養。２５０ ｍＬ的三角瓶裝５０ ｍＬ發酵培養基，接種菌占培養基的體積分數為２％，３７℃、１５０ ｒ／ｍｉｎ搖床振蕩培養４８ ｈ。

１．２．２粗酶液的制備把經過產酶培養后的發酵液用無菌槍頭吸取到１．５ ｍＬ的離心管里，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ，離心１０ ｍｉｎ，取出上清液，即為粗酶液。

１．２．３脂肪酶活力測定方法①脂肪酶活力測定。測定脂肪酶活力的方法有多種，本文選用堿滴定法［６］。脂肪酶作用于聚乙烯醇與橄欖油乳化形成的底物，將底物中的酯鍵水解生成脂肪酸，用標定好的標準ＮａＯＨ溶液滴定反應體系中的脂肪酸，以酚酞作為指示劑，滴定到終點后，根據所消耗ＮａＯＨ的量來計算脂肪酶的活力。酶活力的定義具體參照文獻［７］，用橄欖油乳化液作為底物進行測定，在５０ ℃、ｐＨ值６．０條件下，每分鐘催化底物生成

１ μｍｏｌ脂肪酸所需的酶量定義為一個活力單位（Ｕ）。相對酶活力是指所測得的酶活力值與最高酶活力值的百分比。②脂肪酶活力的計算。脂肪酶活力（Ｕ／ｍＬ）＝（Ｖ１－Ｖ２）×Ｃ×１ ０００／t。式中，Ｖ１為滴定樣品時消耗氫氧化鈉標準溶液的體積（ｍＬ）；Ｖ２為滴定對照（未經處理的酶液為對照）時消耗氫氧化鈉標準溶液的體積（ｍＬ）；Ｃ為氫氧化鈉標準溶液濃度（ｍｏｌ／Ｌ），即０．２５ｍｏｌ／Ｌ；t為酶反應時間（ｍｉｎ），即１５ ｍｉｎ。

２結果與分析

２．１酶反應最適溫度

為了測定酶反應的最適溫度，將反應溫度設置為８個梯度：２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０和９０ ℃。在反應組里加入１ ｍＬ酶液，分別置于８種溫度下進行水解反應１５ ｍｉｎ，按照脂肪酶測定的堿滴定法測定酶活。由圖１可知，酶反應的最適溫度為６０ ℃，且在５０～７０ ℃條件下仍有較高的活力。

２．２酶的熱穩定性

將恒溫水浴溫度設置為５個梯度：５０、５５、６０、６５、７０ ℃。取１ ｍＬ酶液分別置于不同溫度的恒溫水浴鍋中保溫３０ ｍｉｎ，用未經處理的酶液作對照，測定脂肪酶的酶活力。由圖２可知，該酶具有較好的熱穩定性，在５０～６０ ℃的條件下，保溫３０ ｍｉｎ，其相對酶活力仍保持在８５％以上；溫度高于６０ ℃時，酶活性迅速下降，在65 ℃時，相對酶活力為70%；在７０ ℃時，相對酶活力下降到不足３０％。

２．３酶反應的最適ｐＨ值

分別將不同ｐＨ值（２．０～９．０）的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液與底物充分混和，加入１ ｍＬ酶液在最適溫度６０ ℃條件下反應１５ ｍｉｎ，測定酶活力。由圖３可知，該酶在ｐＨ值６．０時的酶活力最高，可知該酶為中性脂肪酶。

２．４酶的ｐＨ穩定性

將酶液與不同ｐＨ值（４．０～８．０）的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液等體積混合，室溫下靜置３０ ｍｉｎ，在６０ ℃，ｐＨ值６．０的條件下反應１５ ｍｉｎ，測定酶活力。由圖４可知，在ｐＨ值４．０～７．０的范圍內，相對酶活力仍保持在７０％以上，酶活性較為穩定。

２．５金屬離子對酶活力的影響

用去離子水配制１２種濃度為１０ ｍｍｏｌ／Ｌ的金屬鹽溶液，用酶液和金屬離子溶液等體積充分混勻，以未加金屬離子的酶液作為對照，室溫下放置３０ ｍｉｎ，以對照組酶活力為１００％，用堿滴定法測定其酶活力。由圖５可知，Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、Ｋ＋對酶有激活作用，Ｆｅ３＋、Ｐｂ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｕ２＋、Ａｌ３＋、Ｚｎ２＋對酶活力有明顯的抑制作用；ＥＤＴＡ、Ｎａ＋、Ｍｇ２＋對酶活力的影響不大。

２．６表面活性劑對酶活力的影響

配制不同種類及濃度的表面活性劑溶液，如表１所示，分別?。担埃?μＬ表面活性劑溶液和５００ μＬ酶液等體積混合，以未處理的酶液作為對照，室溫下放置１ ｈ，測定各試驗組及對照的相對酶活力，以對照組酶活力為１００％。結果表明，濃度為０．５ mL/L的Ｔｗｅｅｎ ８０、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００和濃度為０．１ mL/L的ＴｒｉｔｏｎＸ－１００均對酶活力有促進作用，兩種濃度的ＳＤＳ對酶活力均有抑制作用，兩種濃度的ＥＤＴＡ對酶活力也有一定的抑制作用，只有０．１ mL/L的Ｔｗｅｅｎ ８０對酶活影響不大。

３小結

最近幾年，各行各業的快速發展，對脂肪酶耐酸、耐堿、耐高溫等特性提出了新的要求，而且已經成為國內外脂肪酶研究的一個重要方向［８，９］。本試驗的研究結果表明，該菌株所產脂肪酶的最適反應溫度為６０ ℃，為高溫脂肪酶，且在５０～６0 ℃下仍具有較高的酶活力，具有一定的溫度耐受性。最適ｐＨ值為６．０，在ｐＨ值４．０～７．０內酶活力較為穩定，有一定的耐酸性。表面活性劑中，濃度為０．５ mL/L的Ｔｗｅｅｎ ８０、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００和濃度為０．１ mL/L的ＴｒｉｔｏｎＸ－１００對酶活力均有促進作用；這些性質表明該菌株具有較大的開發潛力。

參考文獻：

［１］ ＤＡＶＩＳ Ｂ Ｇ， ＢＯＹＥＲ Ｖ． Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［Ｊ］． Ｎａｔ Ｐｒｏｄ Ｒｅｐ，２００１，１８（６）：６１７－６４２．

［２］ 溫建新，施碧紅，吳偉斌，等． 脂肪酶產生菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＦＳ３２１的分離鑒定及其產酶條件的初步優化［Ｊ］．食品與發酵工業，２００８，３４（２）：３７－４１．

［３］ 王威． 發展生物質能產業迫在眉睫［Ｊ］． 新經濟導刊，

２００４（２１）：４４－４６．

［４］ 韓德奇，袁旦，王盡濤，等． 生物柴油的現狀與發展前景［Ｊ］． 石油化工技術經濟，２００２，１８（４）：３２－３７．

［５］ ＪＡＥＧＥＲ Ｋ Ｅ ，ＥＧＧＥＲＴ Ｔ． Ｌｉｐａｓｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｊ］． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２００２，１３（４）：３９０－３９７．

［６］ 姜錫瑞，段鋼． 新編酶制劑實用技術手冊［Ｍ］． 北京：中國輕工業出版社，２００２．

［７］ 施巧琴． 堿性脂肪酶的研究［Ｊ］．微生物學通報，１９８１，８（３）：１０９－１１０．

［８］ 汪小鋒，王俊，楊江科，等． 微生物發酵生產脂肪酶的研究進展［Ｊ］． 生物技術通報，２００８（４）：４７－５３．

［９］ 彭立鳳． 微生物脂肪酶的研究進展［Ｊ］． 生物技術通報，１９９９，

１５（２）：１７－２２．