萊克多巴胺殘留檢測的不確定度分析

摘 要:建立液相色譜法測定豬肝中萊克多巴胺殘留量檢測的數學模型;通過對測量過程中不確定度分量來源的分析，計算各分量的標準不確定度及其自由度，最后合成標準不確定度及其擴展不確定度與有效自由度。

關鍵詞:不確定度評定 萊克多巴胺 高效液相色譜法 豬肝

中圖分類號:TS207文獻標識碼:A文章編號:1674-098X(2011)12(b)-0090-02

數據的準確可靠對分析工作而言是至關重要的，不確定度表征合理地賦予被測量之值的分散性，定量表示測量的準確性。ISO/IEC17025－2005《檢測和校準實驗室能力認可準則》也明確規定，檢測實驗室應對測量結果給出不確定度評定。本文根據有關標準，結合對實際操作條件的分析，對液相色譜法對豬肉中萊克多巴胺殘留量的測量不確定度進行評估。

1 儀器、試劑與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent1200高效液相色譜儀(FLD檢測器)、離心機、pH計、梅特勒XS-104電子天平;E120H超聲波清洗器、恒溫干燥箱等;鹽酸萊克多巴胺對照品(含量:98.0±0.5%)其他試劑均為分析純。

1.2 標準曲線的制備:

精密稱取萊克多巴胺對照品約10mg置于100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻制成0.1mg/ml的溶液作為標準儲備液。

精密量取上述標準儲備液1ml，2ml分別置于100ml的容量瓶中，加2%的乙酸溶液稀釋至刻度搖勻制成1μg/ml及2ug/ml的標準溶液，精密量取1ug/ml的標準溶液5ml、2ml、1ml分別置于10ml的容量瓶中，加2%的乙酸溶液稀釋至刻度搖勻制成0.5μg/ml、0.2μg/ml及0.1μg/ml的標準溶液，精密量取1μg/ml的標準溶液5ml置于100ml的容量瓶中，加2%的乙酸溶液稀釋至刻度搖勻制成0.05μg/ml的標準溶液。精密量取上述標準溶液注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，按照濃度與峰面積制作標準曲線，回歸方程:Y=-0.00216+0.00273X(相關系數r＝0.9999)，其中Y為濃度，X為峰面積。

1.3 樣品殘留量的測定過程

精密稱取勻漿好的豬肝樣品約5g，置于50ml的塑料離心管中加入乙腈20ml，漩渦振搖15min，于4℃的冷凍離心裝置上以3500r/min離心10min，取上清液。將上述肝樣用20ml的乙腈按照上述方法重復提取，合并上清液至分液漏斗中，用乙腈飽和的正己烷20ml振搖提取，靜置分層后除去正己烷相，重復提取3次(20ml+20ml+20ml)。乙腈相加入20mL飽和NaCl溶液，液液萃取后分離乙腈相，50℃旋轉蒸干。用2%乙酸溶液洗滌殘渣，過分別用甲醇、水、2%乙酸溶液各5mL活化的SCX固相萃取柱，用5mL的2%乙酸溶液沖洗雜質，最后用7mL5%氨化甲醇溶液洗提。洗提液50℃N2吹干。用1mL的2%乙酸溶液重新溶解，用微孔濾膜過濾，取續濾液作為供試品溶液。

精密量取上述供試品溶液20μl注入液相色譜儀，將峰面積代入標準曲線計算萊克多巴胺殘留量。

2 測量的不確定度來源分析

2.1 測量數學模型

樣品中萊克多巴胺的殘留量按照以下公式計算。

X= (1)

式(1)中:X為樣品中萊克多巴胺殘留量，單位為μg·g-1;C為供試品溶液中萊克多巴胺殘留量的測定值，單位為:μg/ml;V為樣品的最終定容體積;m為樣品的質量;R為空白樣品的加樣回收率。

由公式(1)得合成的測量不確定度為:

Urel(X)=

2.2 C的不確定度評定

2.2.1 校準計算引入的標準不確定度

對于供試品溶液的濃度采用標準曲線法測定，設標準曲線方程為:y=a+bx，則供試品溶液的濃度測定的數學模型為y=a+bx，其中y為待測溶液的濃度，x為待測溶液的色譜峰面積。

該分量的標準不確定度為:Urel(X)=

(1)標準曲線方程參數的不確定度

其中，標準溶液的平均濃度=0.310，系列濃度的平均峰面積響應=114.42。

計算得回歸曲線方程參數:b=SXY/SXX=0.00273，a=Y-bX=-0.00216，s==0.00414。

s2(b)==7.024×10－10，s(b)=2.65×10－5，自由度為:V(a)=m×n-2=6×2－2＝10。

s2(a)==2.062×10－5，s(a)=0.0045，自由度為:V(b)=m×n-2=6×2－2＝10。

(2)峰面積A測量的標準不確定度

儀器色譜峰面積積分的相對標準不確定度為1.0%，均勻分布屬于B類，按可靠性約20%計算其自由度為:V(A)==12

因此，用標準曲線方程計算待測濃度時引入的相對標準不確定度為:

Urel(X)==

=0.011

自由度

ν(X)===16.7

2.2.2 標準溶液引起的不確定度

(1)對照品溶液的純度引起的不確定度:

對照品純度的不確定度為±0.5%，按正態分布置信水平為95%，純度的標準不確定度為:U1=0.005/2=0.0025，自由度ν1=∞

(2)稱量引入的不確定度:十萬分之一電子天平的允許誤差為±0.01mg，按照均勻分布，標準不確定度為:0.01/=0.0058mg，稱取對照品分為兩次獨立的稱量過程:一次毛重，一次皮重，計算得天平校準的標準不確定度為:=0.0082mg。所以，稱取10.05mg對照品的相對標準不確定度為:U2=0.0082/10.05=0.00082。自由度為∞

(3)稀釋過程引入的標準不確定度:

①標準儲備液制備引入的不確定度:100ml容量瓶引允許誤差為±0.10ml，按照均勻分布，其標準不確定度為:0.10/=0.058ml，甲醇的熱膨脹系數為1.22×10－3/℃，設溫差為5℃，則因溫度引起的體積變化為:±1.22×10－3×5×100＝±0.61ml，按均勻分布處理，其標準不確定度為:0.61/=0.35ml。合并上述兩項，計算該步驟相對標準不確定度為:

/100=0.0035

②稀釋過程中引起的標準不確定度:

上述刻度為1ml、2ml、5ml的A級移液管的容量允差分別為:±0.007ml、±0.010ml、±0.015ml，其相對標準不確定度分別為:±0.007//1=0.004、±0.010//2=0.003、±0.015//5=0.002;上述10ml、100ml單刻線容量瓶的容量允差分別為±0.020ml、±0.10ml，均按照均勻分布處理，其相對標準不確定度分別為:±0.020//10=0.0012、±0.10//100=0.00058。水的熱膨脹系數為2.1×10－4/℃，設溫差為5℃，甲醇的膨脹系數為1.22×10－3/℃，溶劑的膨脹系數對各玻璃量器的相對標準不確定度的影響沒有差異，同時，計算應選取最大的不確定度值，即選擇0.10ug/ml標準溶液的相對標準不確定度:

=0.0055

由上述結果可知，由標準儲備液配制系列標準溶液引入的體積相對不確定度為:

U3==0.0065

標準溶液本身的相對標準不確定度為:

==0.0070，，自由度為∞

2.2.3 測試過程隨機效應引入的相對標準不確定度:

對同一豬肝樣品重復測定5次，結果分別為0.973μg/ml，0.987μg/ml，0.998μg/ml，0.965μg/ml，0.982μg/ml，平均值為0.981μg/ml，相對標準偏差為:0.013，自由度為:n=5-1=4.

綜上可知，C相對標準不確定度為:

Urel(C)==0.018

自由度

ν(C)===13.1

2.3 定容體積引入的不確定度

樣品經過凈化、濃縮后用2ml的移液管定容至2ml，根據檢定結果知，2ml移液管的允差為0.008ml，假設允差按照均勻分布，其標準不確定度為:0.008/=0.0046ml，2%乙酸溶液的熱膨脹系數可以近似認為2.1×10－4/℃，按均勻分布處理，其標準不確定度為2.1×10－4×5×2/＝0.0012ml，所以由定容體積引起的相對標準不確定度為:

Urel(V)==0.0024，自由度ν(V)為∞。

2.4 樣品質量引入的不確定度

供試品的稱重在萬分之一天平上進行，天平的允許誤差為±0.0001g，按照均勻分布，標準不確定度為:0.0001/=0.000058mg，稱取對照品分為兩次獨立的稱量過程:一次毛重，一次皮重，所以，稱取10.05mg對照品的相對標準不確定度為:

Urel(M)=/5=0.000016，該項不確定度的自由度為∞。

2.5 回收率的不確定度

制樣過程中產生的不確定度采用0.1ug/ml的對照品溶液1ml加入到5g空白樣品中計算加樣回收率得到。5次測量的結果分別為:70.8%，69.4%，71.4%，72.2%，66.7%，平均加樣回收率=70.1%，標準偏差SR=2.16%，則平均值的標準不確定度為:0.0216/=0.0216/=0.97%;相對標準不確定度為Urel(R)=0.97%/70.1%=0.014，自由度為:n=5-1=4。

可以得出，平均回收率=70.1%與100.0%的理想值(t(0.99，4)=4.60)有顯著性差異，有采用回收率對結果進行校正的必要。結果計算如下:

t==30.82

3 合成不確定度及擴展不確定度:

相對合成不確定度==0.023

合成不確定度=0.023×0.981/5=0.0045μg/g

有效自由度為:

νeff==15.9

取置信水平為95%，包含因子為k=2，則擴展不確定度=0.0045×2＝0.0090μg/g

參考文獻

[1]王叔淳食品分析質量保證與實驗室認可.北京:化學工業出版社，2004.

[2]GB12806-1991實驗室玻璃儀器單刻線容量瓶[s].

[3]劉青峰，陳英，謝曉峰等。高效液相色譜法測定茶飲料中苯甲酸、山梨酸的測量不確定度的評定[J].化工之友，2007(9):35～36.

[4]馮冰，張佳宜，王英等。豬肝中萊克多巴胺殘留的分析研究[J].食品研究與開發，2007，Vol.28.NO.04:147～149.